阿尔茨海默病患者外周血淋巴细胞DNA端粒长度与认知功能的关系

晏玉奎 孙晓燕 钮富荣

[摘要] 目的 探讨AD患者认知功能障碍及其严重程度与淋巴细胞DNA端粒长度的关系。方法 方便采集2005年1月—2018年4月该院就诊的82例AD患者的临床资料，进行MMSE、CDR及MoCA量表评分，并采集AD患者外周血，RT-PCR法测定DNA端粒长度，Kaplan-Meier法分析AD患者疾病严重程度与DNA端粒长度的关系。结果 轻中度CDR、MMSE评分患者较重度患者，其生存函数时间长，模拟DNA端粒长度具差异有统计学意义（Log-Rank=1.82，P=0.006;Log-Rank=1.46，P=0.004），具有輕中度MoCA量表评分的AD患者较重度患者，其生存函数时间长，模拟DNA端粒长度同样差异有统计学意义（Log-Rank=1.28，P=0.005）。结论 AD患者外周血淋巴细胞DNA端粒长度与认知功能具有一定的量变关系。

[关键词] AD患者;DNA端粒长度;认知功能

[中图分类号] R749.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）04（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between cognitive dysfunction and telomere length of lymphocyte DNA in AD patients . Methods The clinical data of 82 AD patients were collected from January 2005 to April 2018. The MMSE， CDR and MoCA scales were scored， the peripheral blood of AD patients were convenient collected， and the length of DNA telomeres was determined by RT-PCR. Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the severity of disease and DNA telomere length in AD patients. Results Compared with the patients， who had severe CDR and MMSE scores， the patients with mild to moderate MMSE and CDR scores had long survival function time， and simulated DNA telomere length had statistical differences（Log-Rank=1.82， P=0.006; Log-Rank=1.46， P=0.004）. Compared AD patients， who had severe MoCA scale score， the patients with mild to moderate MoCA scale score had long survival function time， and simulated DNA telomere length also had statistical differences （Log-Rank=1.28， P=0.005）. Conclusion There is a quantitative relationship between DNA telomere length of peripheral blood lymphocyte and cognitive function of patients with AD.

[Key words] AD patient; DNA telomere length; Cognitive function

阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD） 是最常见的痴呆类型，属于神经退行性疾病的一种，其临床特点是严重的认知功能障碍，学习和记忆能力障碍，判断力、定向力及语言功能的下降等[1]。年龄是AD的高危因素，但两者之间的关系仍不清。端粒是细胞老化过程中的关键元件，一旦端粒缩短到一定的程度，细胞分裂将会停止，细胞进入衰老状态，因此，端粒在人体中充当“分子钟”的作用，在正常躯体细胞中，端粒随年龄增长而缩短，并呈线性关系，此现象已在人类外周血细胞中观察到，而且近期研究发现端粒-端粒酶系统的稳定与人类的衰老及相关疾病如AD有密切关系[2]。然而，对于AD患者认知功能障碍及其严重程度与淋巴细胞DNA端粒长度的关系尚未报道，因此方便选取2005年1月—2018年4月就诊于该院痴呆中心的AD患者82例为研究对象，初步分析确诊AD患者与外周血淋巴细胞DNA端粒长度的关系，试图为揭示该病发病机制提供一些线索。

1  对象与方法

1.1  研究对象

所有病例方便选自该院痴呆中心，共82例患者，年龄68～91岁，平均（68.3±15.3）岁;所有患者均缓慢起病，就诊时平均时间为28个月（9～65）月，纳入标准：由至少2名有经验的神经科专科医师诊断为临床很可能的AD，AD的诊断依据为修订版美国国立神经病学、语言障碍和卒中研究所-阿尔茨海默病及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）标准。该研究经过该院伦理委员会批准，并得到所有家属或患者的知情同意。

1.2  认知量表测定

所有AD患者均由专科医师进行临床痴呆评定量表（CDR）、简易精神状态检查（MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（MoCA）中文版，其中CDR分为轻度（CDR评分=1分）、中度（CDR评分=2分）和重度（CDR评分=3分），MMSE量表包括5部分：定向力、即刻记忆、计算力、短时记忆及语言能力，根据文化程度得分判断：文盲≤17分，小学≤20分，初中及以上≤24分存在认知障碍，得分越低越严重。MoCA量表包括：注意力和集中，执行功能，记忆力，语言能力，视空间，抽象思维，计算，以及定向力。每份MoCA量表限制在10分钟内完成，总分为30分，≥26分为正常，得分越低说明痴呆越严重。

1.3  外周血淋巴细胞DNA端粒长度测定

从肝素抗凝5 mL外周血中分离T、B淋巴细胞，分离过程按制造商说明，分离纯度要求达到95%以上。按Rufer描述的方法，通过流式细胞仪测定，染色使用碘化乙胺（PI）（Sigma公司），端粒杂交采用0.3 ug/mL端粒特异FITC共轭粒酸肽探针（FITC为异硫氰酸荧光素）（Biosystem公司），热变性在Thermomixer上进行（Sigma公司），由FACScan 软件进行分析，实际荧光强度通过与标准曲线比较，获得端粒末端长度。采用罗氏公司端粒长度检测试剂盒检测外周血细胞端粒长度（TAGGG序列），由于端粒没有特异性酶切位点，基因组DNA采用限制性内切酶的混合酶切法，于0.8%琼脂糖凝胶5 V/cm电泳4 h后，将凝胶变性、中和，以虹吸印迹法将DNA转移至带正电的尼龙膜上，烘烤20 min;42℃预杂交1 h后，加入地高辛标记的端粒探针杂交3 h;洗膜后进行化学发光显影，所得光片经光密度扫描成像，采用端粒长度分析软件进行分析，计算各样本端粒长度。

1.4  统计方法

应用SPSS 15.0统计学软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用配对t检验。为了探索线粒体DNA拷贝数，端粒长度与受试者认知临床性状之间的相关性，我们采用Kaplan-Meier分析生存函数相关性检验进行分析。所有的检验水准为α=0.05，取双侧检验。

2  结果

2.1  不同程度痴呆患者的临床比较

该研究共收集82例不同程度痴呆患者，均按要求完成神经心理测评，根据痴呆评定量表分值（CDR）发现有轻度患者18例，中度患者34例，严重患者30例。根据CDR评分，其中轻、中度患者52例，重度患者30例，其MMSE评分和MoCA量表得分见表1。

2.2  不同临床痴呆评定量表分值（CDR）与端粒长度的关系

Kaplan-Meier分析生存函数曲线图显示：每组不同临床痴呆评定量表分值生存率逐渐下降，轻中度与重度CDR的不同时间生存差异有统计学意义，Log-Rank=1.82，P=0.006。

图1 轻中度AD患者（1分、2分）患者与重度AD患者（3分患者），其中曲线1表示轻中度，曲线2为重度，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3  不同程度痴呆患者简易精神评定量表分值（MMSE）与端粒长度的关系比较

Kaplan-Meier分析生存函数曲线图显示：每组不同临床痴呆评定量表分值生存率逐渐下降，轻中度与重度患者的不同时间生存差异有统计学意义，Log-Rank=1.46，P=0.004。

图2   轻中度MMSE得分患者与重度MMSE得分AD患者，其中曲线1表示轻中度，曲线2为重度，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4  不同程度痴呆患者MoCA量表得分与端粒长度的关系比较

Kaplan-Meier分析生存函数曲线图显示：每组不同MoCA评定量表分值生存率逐渐下降，轻中度与重度MoCA分值的不同时间生存差异有统计学意义（Log-Rank=1.28，P=0.005）。

图3   轻中度MoCA得分患者与重度MoCA得分AD患者，其中曲线1表示轻度，曲线2为重度，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构 ，由富含G的DNA重复序列及其相关蛋白组成，对于维持染色体稳定性具有十分重要的意义，端粒长度决定细胞的寿命，端粒随着细胞分裂而逐渐缩短，与衰老如痴呆和癌变有密切的关联。 因此，端粒长度缩短被认为是老化的生物标记。2009年诺贝尔生理学与医学奖获得者就是在端粒的研究方面具有突出贡献，目前有多个研究发现其与年龄相关疾病如痴呆之间有关联，随着全球人口老龄化趋势加重以及分子生物学的研究进展，老年痴呆的检出率逐渐增高，而对端粒及其长度研究的不断深入，AD与端粒之间的联系也会逐渐清晰[3]。

正是由于端粒长度与衰老与认知障碍有密切关系，有研究者认为端粒长度可以预测健康、疾病及衰老死亡。郭令军等分别提取不同年龄组的外周血DNA，采用实时荧光定量PCR发现40～49 岁组的白细胞端粒（1.5±0.87）kb 长于 60～69 岁组（0.8±0.16）kb（P<0.05），认为随着年龄增加即使是健康人，其外周血白细胞的端粒也在缩短[4]，也有研究者发现，年龄与端粒相对长度呈负相关，而且运动能力及耐力可以反应端粒相对长度的变化，对人体抗衰老和认知障碍有积极的促进作用[5]。

以上研究证实在正常的衰老过程中，端粒长度变在生理性老化中扮演着重要角色，在疾病状态中，相关研究等在对65岁以上老年人的长期随访中发现，随访期间死亡者有较短的端粒长度;并且与无痴呆者比较，期间发展为痴呆者也有显著较短的端粒长度，提示缩短的外周血白细胞端粒长度与痴呆的风险和死亡率相关（P<0.05），是早发痴呆的危险因素[6]。有关学者的研究也显示，AD组外周血细胞端粒长度（1.4±0.67）kb显著短于健康对照组（1.8±0.44）kb（t=11.23，P<0.05），而轻度认知功能障碍（MCI）组（1.7±0.32）kb与健康对照组（1.8±0.44）kb无差别（t=0.92，P>0.05），提示AD病理改变可能进一步加速端粒长度的缩短[7]。本研究通过Kaplan-Meier生存函数，分析轻、中度与重度AD患者端粒缩短的模拟时间函数，发现轻中度CDR、MMSE评分患者较重度患者，其生存函数时间显著延长，模拟DNA端粒长度具有统计学差异（Log-Rank=1.82，P=0.006;Log-Rank=1.46，P=0.004），具有轻中度MoCA量表评分的AD患者较重度患者，其生存函数时间显著延长，模拟DNA端粒长度同样差异具有统计学意义（Log-Rank=1.28，P=0.005），與上述不同认知功能障碍患者为研究对象，其结果一致。AD的认知功能下降与抑郁症有密切关系，有国内学者撰文发现抑郁症患者外周血淋巴细胞（CD4+、CD8+、CD20+）的DNA端粒长度明显比对照组缩短（t=6.21，P<0.05）[8]，而该研究利用多元统计，模拟从不同认知功能障碍程度阐述端粒时间-速度函数变化关系，认为轻中度AD患者较重度AD患者的端粒衰减速度减慢或者具有较长的DNA端粒，进一步说明痴呆与端粒长度缩短有一定量变关系。

也有证据显示在认知功能不同的AD患者中，对比外周血端粒长度后发现，轻度认知障碍组转变为AD组的端粒长度与健康对照组无明显差异，而稳定轻度认知障碍患者的端粒长度反而短，提示AD发生中的病理过程可能不是由正常生理老化来驱动[9]。由此可见，衰老、端粒长度与AD这三者之间关系复杂。但是，端粒长度与衰老关系，反映人的衰老指标越来越被重视，积极寻找各种类型生物学标志物，是当今认知障碍研究领域迫切面临且需要解决的问题，端粒长度研究在这方面已经具有优势，该研究还需要进一步探讨。

[参考文献]

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[2]  杨吉庆，黄兆样，梁杰，等.測定端粒长度推断法医学年龄的研究进展[J].河南科技大学学报：医学版，2016，34（2）：156-160.

[3]  田慧敏. 端粒与细胞衰老及肿瘤诊断、治疗的关系[J]. 赤峰学院学报：自然科学版，2017（13）：26-27.

[4]  郭令军， 张七一. 实时定量 PCR 分析外周血白细胞的端粒长度[J]. 中外医疗， 2008，27（21）：1-2.

[5]  王艳， 王正珍. 40 -59 岁女性体力活动水平与端粒体相对长度的相关性[J]. 北京体育大学学报， 2015， 38（6）：55-59，88.

[6]  Montiel Rojas D，Nilsson A，Ponsot E，et al. Short Telomere Length Is Related to Limitations in Physical Function in Elderly European Adults[J]. Front Physiol，2018，10（9）：1110.

[7]  Seeker LA，Ilska JJ，Psifidi A，et al.Bovine telomere dynamics and the association between telomere length and productive lifespan[J].Sci Rep，2018，8（1）：12748.

[8]  贾立娜，于鲁璐，王学义，等. 与精神障碍相关的端粒、端粒酶研究进展[J]. 国际精神病学杂志， 2015（5）：59-61.

[9]  Scarabino D，Broggio E Gambina G，et al. Leukocyte telomere？length in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease patients[J]. Exp Gerontol，2017， 11（98）：143-147.

（收稿日期：2019-01-23）