不同DRD2TaqIA基因型美沙酮维持治疗的海洛因成瘾者岛叶功能连接差异的rs-fMRI研究

胡风，王磊，时宏，李小怀，李玮，李强，王玮，王亚蓉*

药物成瘾是环境因素、药源性生理异常、基因易感性多因素综合作用的结果[1]。以海洛因成瘾为代表的药物滥用构成了严重的健康问题，目前仍然没有找到有令人满意的治疗手段，即使作为主流疗法的美沙酮替代治疗(methadone maintenance treatment，MMT)也存在着相当显著的复吸情况[2]。研究表明，成瘾过程和治疗效果与患者大脑多巴胺系统效能有密切关系，而多巴胺D2受体(dopamine Receptor D2，DRD2) TaqIA基因型(A+、A-型)是调节其效能的重要基因[3]。此外，近年来研究发现岛叶是DRD2的主要分布区之一，并且在维持物质成瘾行为过程中的重要作用受到关注[4]。但是，目前DRD2TqIA基因型如何通过脑岛调节成瘾患者成瘾行为的机制尚不清楚。因此，本研究以双侧岛叶为静息态功能连接分析的种子区，探讨不同DRD2TqIA基因型海洛因成瘾者，岛叶与全脑功能连接(functional connectivity，FC)的差异，分析DRD2TaqIA基因型调节海洛因成瘾者大脑内感受状态及其与美沙酮维持治疗疗效的神经机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2012年10月至2013年1月西安市灞桥区美沙酮维持治疗门诊的男性海洛因依赖患者(heroin dependence，HD)47例，采集被试唾液，采用PCR-RLFP基因技术，分析被试DRD2受体基因，将其分为A+组(27例)和A-组(20例)。两组间年龄、受教育程度、吸烟史、海洛因滥用史美沙酮维持治疗史相匹配(表1)。受试者本人均自愿参加本研究，并于实验前签署知情同意书。本研究通过空军军医大学唐都医院伦理委员会批准。

被试纳入标准：(1)所有被试符合美国精神疾病诊断与统计手册(DSM-V)的物质依赖诊断标准；(2)均为单纯海洛因依赖，无海洛因外的非法药物滥用史，吸食方式采用烫吸和/或静脉注射；(3)受试者均为男性，右利手：(4)美沙酮维持治疗时间不少于一年时间。排除标准：(1)脑器质性病变者及较严重头部外伤史；(2)本人及一级亲属为精神疾病患者；(3)严重心肝肾功能不全者；(4) HIV阳性；(5)幽闭恐惧症及其他核磁共振检查禁忌者。所有被试在检查当日均未服用美沙酮，并进行尿检，以确保处于脱毒期。

1.2 数据采集与处理

1.2.1 DNA收集及DRD2 TaqIA基因分型

MR扫描前采集每个被试唾液样本，根据毕匹生物科技有限公司R6731-02 Oragene DNA self-collection kit说明收集并保存于冰箱内。DRD2 TaqIA基因多态性测定由美国应用生物系统公司(上海)用TaqMan SNP Genotyping Assay进行测定、分型。

1.2.2 图像采集

采用美国GE Signa Excite HD 3.0 T磁共振扫描仪和8通道标准头线圈进行fMRI数据采集。为减少头动伪影，扫面前要求受试者加垫泡沫海绵及佩戴降噪耳塞。扫描过程受试者仰卧，通过反光镜平静注视屏幕上的“+”，尽量保持思维平静状态，不能睡眠。rsfMRI扫描用平面梯度回波(echo-planar imaging，EPI)序列，扫描参数：TR 2000 ms，TE 30 ms，矩阵64×64，FOV 256 mm×256 mm，层厚4 mm，层数32，反转角90°。三维结构像采用FSPGR序列，TR 7.8 ms，TE 3.0 ms，反转角20°，采集矩阵256×256，层厚1 mm。正式采集数据前10 s空扫以稳定信号，采集150个时间点，扫描时间共持续310 s。

1.2.3 静息态数据处理

图像预处理基于MATLAB (R2012a)平台，采用中科院心理研究所dpabi (Data processing & Analysis for Brain Image)软件。去除扫描前10×32张图层，以剔除最初信号不稳定及被试适应过程影响。首先进行时间校正，以第1张全脑图像为标准进行图像对齐并进行头动校正，因扫描时间较长，呼吸、心跳等生理活动会对头动有所影响，因此被试头动在任意方向超过2.0 mm或旋转角度超过2°将被剔除于本研究之外；然后进行图像配准，按体素3 mm×3 mm×3 mm重采样，用FWHM 4 mm的高斯平滑核进行空间平滑，减少空间噪声。最后进行滤波(0.01 Hz＜f＜0.1 Hz)，排除低频线性漂移以及高频噪声(如呼吸、心跳等)。本研究仅关注神经元活动，所以将全脑信号、白质、脑脊液信号作为协变量进行多元回归分析。

1.2.4 功能连接分析

功能连接(functional connectivity，FC)是一种基于ROI的网络分析方法，它是基于某种假设或文献选择某个脑区作为感兴趣区，提取该脑区的平均时间序列信息，然后计算该ROI与全脑其它体素的之间的时间序列相关性。最终根据一定的阈值分析出具有具有统计学意义的关系脑区，这些脑区被认为是该ROI有功能连接的脑区[5]。功能连接的强弱用FC值表示，FC值越强表示该ROI与相关脑区的时间序列的同步性越强。本研究将自动解剖标签(anatomical automatic labeling，AAL)模板的双侧岛叶作为感兴趣区，提取每个被试感兴趣区的平均时间序列作为种子时间序列，计算该种子时间序列和全脑每个体素时间序列Pearson相关系数。最后利用Fishers'r-to-z转换将相关系数进行正态性变换，进而得到岛叶与全脑的功能连接数据。

图1 与A-组相比较，A+组右侧岛叶与全脑功能连接减低的脑区：双侧尾状核、双侧背外侧前额(体素＞5，P＜0.001，FDR校正)Fig. 1 Compared with A- group, A+ group demonstrated reduced FC between the right insula and the bilateral dorsolateral prefrontal cortex, and the bilateral caudate nucleus (cluster size ＞5, P＜0.001, FDR correction).

表1 两组受试者一般人口学资料(x±s)Tab. 1 Demographic and clinical characteristics of paticipants(x±s)

1.2.5 复吸检测

以本次实验fMRI扫描当天为基准，进行为期12个月的回访，对每个海洛因成瘾被试进行每个月固定的尿检测试及当面访谈，任何一次自我报告存在海洛因使用情况或尿检阳性即被认定为当月复吸，在本研究中，将实验完成后至第一次复吸行为发生时间段(月)称为美沙酮维持治疗的操守时间。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计分析软件，对A+组和A-组间人口学资料和用药情况做两样本t检验，计算资料以x±s表示。组间FC值的比，采用dpabi的统计分析软件，进行A+组和A-组的两样本t检验(P＜0.001，FDR校正)。将年龄、日均MMT用药量作为协变量，对组间差异区的FC的连接强度与操守时间进行偏相关分析(P＜0.05为差异有统计学意义，Bonferroni校正)。

2 结果

2.1 人口学资料统计

A+组与A-组人口统计学资料(年龄、受教育程度、吸烟、海洛因及美沙酮使用情况)的比较无统计学意义(P＞0.05)(表1)。

2.2 组间功能连接分析结果

与A-组相比，A+组右岛叶与双侧尾状核、双侧背外侧前额叶功能连接强度明显减低(P＜0.001，FDR校正，体素＞5)，未发现功能连接强度增高的脑区；两组间左侧岛叶与全脑功能连接无显著性差异(图1，表2)。

表2 A+组比A-组静息态功能连接差异Tab. 2 Different brain areas of functional connectivity during resting-statse in A+ group vs. A- group

图2 偏相关结果：右侧岛叶与右侧背外侧前额叶FC值强度与MMT操守时间呈正相关(r=-0.378，P=0.011，Bonferroni校正P＜0.05)Fig. 2 The partial correlation demonstrated: FC intensity between the right insula and the right dorsolateral prefrontal cortex had a positive correlation with abstinent time (r=0.378、P=0.011; Bonferroni correction P＜0.05).

2.3 偏相关分析

以年龄、日均美沙酮用量为协变量，右侧岛叶-右侧背外侧前额叶功能连接强度与患者美沙酮维持治疗的保持操守时间呈正相关(r=0.378，P=0.011；Bonferroni校正，P＜0.05)(图2)。

3 讨论

目前，基因调节的多巴胺受体表达在药物成瘾的神经机制研究中成为重点，尤其是多巴胺D2受体TaqIA基因型，已被证明在中脑边缘多巴胺环路的奖赏调节过程中处于核心地位，它两个等位基因分别为A1、A2[6-7]，A1为显性基因，根据基因组合方式又将其携带者分为： TaqIA+型(A1/A1和A1/A2)与TaqIA-型(A2/A2)。流行病调查与研究表明，A+基因型个体更倾向于海洛因、酒精、尼古丁的成瘾，相对于A-型基因个体，在治疗效果上也有更高的失败率[8-10]。岛叶是调节内感受状态的核心脑区，在药物成瘾机制的形成中，内感受状态的异常，会从整体上促使和加重正常的抑制性控制行为向异常的药物渴求行发生倾斜[11]。然而，目前DRD2TaqIA基因型对MMT海洛因成瘾者的内感受状态的神经调节机制仍不明确。因此，本研对不同DRD2TaqIA基因型成瘾者的岛叶功能连接差异进行分析，从内感受这一重要角度，探讨DRD2TaqIA基因型调节海洛因成瘾机制及治疗过程中的调节作用。

传统的理论认为引起药物使用障碍的两个过程，包括强化了的药物显示的动机驱动过程和减弱药物线索引出诱导反应趋势的认知控制过程，而内感受连接了动机驱动和认知控制这两个过程[12]。最近的一个关于岛叶的内感受模型证明：后岛叶编码与动机状态相关的神经活动，前岛叶调节渴求状态的主观意识，这些信息被传递到前扣带回、背外侧前额叶、额下回，然后由前额叶的这些脑区决定维持目前的行为还是终止它[13]。因此这一模型指出在认知控制过程中，岛叶与背外侧前额叶的功能连接改变与药物依赖的机制密切相关。本研究A+型成瘾者脑岛与双侧背外侧前额叶功能连接强度显著减低，这与以上的经典模型和之前的研究相一致[14]。进一步证明，A+型成瘾者的内感受可能具有更弱的协调动机、渴求和认知控制的能力，这种功能连接强度的弱化使A+型成瘾者更易由抑制性控制行为转向药物渴求状态，这可能是A+基因型患者在海洛因使用中更容易成瘾的重要原因。

前额叶皮层是调节多巴胺中脑边缘系统奖赏环路的核心脑区，同时参与更高阶的认知控制功能(自我监控、突显意识控制)活动[15]。认知控制功能损伤在药物滥用的持续性和驱使复吸的过程中有至关重要的角色[16]。事实上，大量的研究将岛叶与前额叶的认知控制过程连接起来[17-18]。例如，研究表明右侧岛叶与前扣带回的相互作用在默认模式和认知控制网络之间的转换至关重要[19]。前岛叶在调节未知过程和追踪危险中的重要性[20]。这些发现强调岛叶与前额叶的重要脑区(额上回、额下回、背外侧前额叶等)共同参与并调节认知控制的过程。笔者研究发现A+型成瘾者右侧岛叶与背外侧前额叶表现出更低的功能连接强度，说明A+型成瘾者背外侧前额叶对内感受冲突监测能力减低，在美沙酮维持治疗过程中，A+型成瘾者也许在调节注意力控制能力和整合觅药冲动与抑制关系的能力上，相对于A-组均表现减低。此外，笔者发现在MMT过程中右侧岛叶与背外侧前额叶功能连接的强度和MMT保持操守时间呈正相关，说明相对于A-组，A+型成瘾者坚持不复吸的时间更短。因此，岛叶和背外侧前额叶这种脑区功能连接的减弱，最终使A+型海洛因成瘾者在强迫性觅药行为中有更低的抵抗性，同时在美沙酮维持治疗过程中更容易产生复吸行为。

尾状核是奖赏环路中的重要脑区，与壳核共同组成背侧纹状体，是大脑多巴胺通路的主要脑区[21]，在大脑中发挥重要的奖励及激励作用。有研究表明，成瘾者在药物线索条件下尾状核发生了显著的脑区活改变，并且变化幅度与自我报告的渴求幅度有相关性[22]，尾状核的奖赏效应是调节控制性和行为性反应的关键环节[23-24]。另一研究对不同多巴胺基因型尼古丁成瘾患者的研究发现，尾状核多巴胺的释放在不同基因型间存在差异[25]，这是因为A+型尾状核及壳核、伏隔核的DRD2受体密度低于A-型。本研究中A+型成瘾者岛叶与尾状核之间的功能连接程度减低，这可能基于A+型尾状核本身相对减低的DRD2受体数量，削弱了多巴胺奖赏效能的神经活动强度；也可能是A+型成瘾者内感受状态下对奖赏效应的影响及调节发生弱化，使整体的内环境平衡发生改变，奖赏环路对抑制控制、动机驱动及学习记忆环路作用发生紊乱及倾斜，最终更加促进成瘾的形成及发展。

本研究的局限性：(1)本研究两组间左侧岛叶与全脑功能连接无显著性差异，这种结果的单侧性可能与我们纳入的被试均为右利手有关；(2)本研究纳入的所有被试均在美沙酮维持治疗过程中存在复吸行为，而非复吸的被试被排除，因为有研究表明[26]，治疗过程中存在复吸行为和无复吸行为的被试的成瘾相关神经机制有显著的区别，而研究不同DRD2TqIA基因型非复吸与复吸成瘾者之间的神经机制差异将是我们下阶段试验的内容。(3)基因型被试量相对较小，且被试均为男性，组间差异的性别易感性不能充分体现。本研究的创新性：首次采用生物遗传学方法将被试按不同DRD2TqIA基因型分组，将内感受的核心脑区-岛叶作为ROI，分析组间大脑功能连接的神经活动差异，依靠rs-fMRI这种可靠技术的桥梁作用，实现基因特征与临床治疗的有效连接，具有研究角度的创新性。

总之，本研究从生物遗传学这一新角度出发，将美沙酮维持治疗的海洛因成瘾者按不同DRD2TqIA基因型分组。证明A+型患者在成瘾及治疗过程右侧岛叶与双侧背外侧前额叶、尾状核的功能连接均表现出减低；这种由内感受主导的抑制控制功能及奖赏环路的脑区活动模式，可能是DRD2TaqIA基因型调节及影响成瘾者神经活动及其美沙酮维持治疗效果的重要途径。而右侧岛叶-右侧背外侧前额叶功能连接强度与MMT操守时间表现出正相关，这提示背外侧前额叶可能在不同基因型的美沙酮维持治疗机制的神经调节中处于重要地位，这为以后对海洛因成瘾者按不同DRD2基因型分型治疗提供了科学依据和潜在的生物学靶点。

利益冲突：无。