奥曲肽对胰腺癌模型大鼠细胞凋亡的影响及作用机制研究

杨梅,柳英辉,陈文习

胰腺癌是一种临床较为常见的消化系统恶性肿瘤，恶性程度极高，直接导致临床诊断和治疗均较为困难[1-2]。胰腺癌症状主要临床表现为腹痛、乏力、黄疸以及一系列的消化道症状，对患者的生活质量造成严重的影响，因此寻找一种安全有效的治疗方法具有重要意义[3]。奥曲肽能够调控胰腺分泌，临床常应用于胰腺炎的治疗，但是关于其对胰腺癌症状干预效果的研究还相对较少。大量实验研究表明，肿瘤组织的发生发展与细胞凋亡能力密切相关[4]，本文研究中设计实验，建立胰腺癌大鼠模型，并使用奥曲肽进行干预，旨在探究奥曲肽对胰腺癌模型大鼠细胞凋亡的影响及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究动物 选取50只SD健康雄性大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，年龄3～5个月，平均年龄(4.1±0.5)月，体质量200～252 g，平均体质量(225.3±10.6)g。所有大鼠均养殖在干净笼子里，室温控制在20.3～23.9 ℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间为1周。本文研究所做实验均获得我院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 奥曲肽(北京诺华制药有限公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2抗体(Gibco公司)；小鼠抗大鼠PI3K抗体(Invitrogen公司)；大鼠抗兔Akt抗体(Sigma公司)；兔抗大鼠IL-6、TNF-α抗体(Dako公司)；PBS缓冲液、SDS-PAGE蛋白缓冲液、TBST缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组 使用随机数字表法选取10只大鼠作为本文研究正常组，不做任何处理，其余40只大鼠进行胰腺癌模型建立，建模方法参照王云检[5]研究中建模标准并作出适当改动：建模前1 d对所有大鼠禁食不禁水。对大鼠进行麻醉处理后于上腹部正中部位作一1 cm左右切口，使胰腺组织暴露出来，在胰腺组织尾部将胰腺组织被膜以及部分实质切开1 mm左右，将9 mg DMBA植入，之后将切口缝合，并进行预防感染处理。1周后对造模大鼠进行观察，大鼠皮下出现直径0.8 cm左右的结节视为建模成功，最终建模成功37只，将37只胰腺癌大鼠随机分为模型组10只以及低、中、高剂量奥曲肽组各9只。分别使用0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg奥曲肽对低、中、高剂量奥曲肽组大鼠进行皮下注射，1次/d，连续给药10周，正常组与模型组大鼠均使用生理盐水进行干预。

1.2.2 标本采集 停止用药后，对五组大鼠进行全麻处理，采用断头法处死，将大鼠胰腺组织完全剥离出来，并对胰腺癌组织体积、质量进行检测，然后进行病理组织切片。

1.2.3 肿瘤细胞凋亡率、周期分布检测 使用流式细胞仪检测细胞凋亡、周期分布情况，将细胞传代至5孔板之中，并将细胞在37 ℃、5% CO2的环境中进行培养，加入0.25%胰蛋白酶消化，使用2 000 r/min的离心机处理5 min后使用PBS缓冲液清洗2次，再次离心处理并收取细胞，加入1 mL PI染液，在避光的常温环境中放置1 h，然后用特异荧光标记后，在鞘液包裹下高速流动中，流动期间会发射出光子，严格按照流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布情况。

1.2.4 HE染色处理 对五组大鼠切片样本进行染色处理，使用二甲苯进行常规脱蜡处理2次，每次5 min，然后在梯度酒精下水花处理3 min，自来水冲洗1次；使用苏木素染色5 min，自来水冲洗1次；使用浓度为1%的盐酸酒精分化处理30 s，在0.2%氨水中反蓝处理2 min，自来水冲洗1次；在浓度0.5%伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片，使用光学显微镜进行图像分析。

1.2.5 Western blot法检测Bcl-2、PI3K、Akt、PTEN、p-Akt、mTOR表达 使用PBS缓冲液清洗标本3次，分离缓冲液之后裂解0.5 h，对蛋白浓度进行测定。取20 μg/孔蛋白质，加入适量SDS-PAGE蛋白缓冲液后电泳10 min，在10%的牛奶中浸泡电转膜，摇床上常温封闭1.5 h；与一抗结合之后使用TBST进行稀释，并孵育、保存；次日使用TBST液进行清洗，与二抗结合后常温孵育1 h，再次清洗，加入显影剂显色，对Bcl-2、PI3K、Akt、PTEN、p-Akt、mTOR表达进行测定。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠胰腺组织病理组织学观察

如图1所示，正常组大鼠胰腺组织正常，模型组大鼠胰腺组织出现大量的炎症细胞浸润现象，细胞排列不规则，低、中、高剂量奥曲肽组大鼠炎症细胞浸润现象出现减轻，高剂量奥曲肽组大鼠仅有轻微的炎症细胞浸润现象，胰腺组织基本正常。

图1 各组大鼠胰腺组织病理组织学观察图(HE染色，×200)

2.2 各组大鼠肿瘤体积、质量比较

如表1所示，模型组大鼠肿瘤体积、质量均高于低、中、高剂量奥曲肽组，差异具有统计学意义(P<0.05)；高剂量奥曲肽组大鼠肿瘤体积、质量均低于低、中剂量奥曲肽组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组大鼠肿瘤细胞凋亡、周期分布情况对比

如表2所示，模型组大鼠肿瘤细胞凋亡率低于其他三组，且高剂量奥曲肽组大鼠肿瘤细胞凋亡率高于低、中剂量奥曲肽组，差异具有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量奥曲肽组处于G1期的细胞比例高于模型组，处于S期与G2期的细胞比例低于模型组，且高剂量奥曲肽组处于G1期的细胞比例高于低、中剂量奥曲肽组，处于S期与G2期的细胞比例低于低、中剂量奥曲肽组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠肿瘤体积、质量比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量奥曲肽组比较，△P<0.05；与中剂量奥曲肽组比较，☆P<0.05

2.4 各组大鼠细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表达情况对比

如表3、图2所示，正常组大鼠细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量均低于其他四组，模型组大鼠细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量均高于低、中、高剂量奥曲肽组，且高剂量奥曲肽组大鼠细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量均低于低、中剂量奥曲肽组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠肿瘤细胞凋亡、周期分布情况对比

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量奥曲肽组比较，△P<0.05；与中剂量奥曲肽组比较，☆P<0.05

表3 各组大鼠细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表达水平对比

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量奥曲肽组比较，△P<0.05；与中剂量奥曲肽组比较，☆P<0.05

图2 Bcl-2、PI3K、Akt表达WB图

2.5 各组大鼠细胞周期蛋白PTEN、p-Akt、mTOR表达情况对比

如表4、图3所示，正常组大鼠细胞周期蛋白PTEN相对表达量高于其他四组，p-Akt、mTOR相对表达量低于其他四组；模型组大鼠细胞周期蛋白PTEN相对表达量低于低、中、高剂量奥曲肽组，p-Akt、mTOR相对表达量高于低、中、高剂量奥曲肽组，且高剂量奥曲肽组大鼠细胞周期蛋白PTEN相对表达量高于低、中剂量奥曲肽组，p-Akt、mTOR相对表达量低于低、中剂量奥曲肽组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

胰腺癌是一种临床较为常见的消化系统恶性肿瘤，相比其他恶性肿瘤，胰腺癌恶性程度更高，因此又被称为“癌症之王”[6]。据相关流行病学调查数据显示，近年来我国胰腺癌症状发病率不断提升，并且发病早期无明显症状，因此早期诊断率相对较低，病死率较高，对患者的身体健康甚至生命安全造成严重威胁[7-8]，但是目前临床医学对胰腺癌症状的发病机理尚未研究透彻，病因的不确定性加上其恶性程度高、多转发、肿瘤耐药等诸多原因，也导致临床上对胰腺癌的治疗一直是一个难题[9-10]。因此，寻找一种安全有效的治疗胰腺癌的方法具有重要意义。

奥曲肽是一种广谱的生长抑素的八肽衍生物，具有较多的生物活性，并且作用时间较长[11]。大量临床研究表明，奥曲肽能够调控胰腺分泌，因此奥曲肽常应用于胰腺炎的临床治疗[12]，但是，关于奥曲肽对胰腺癌症状干预效果的研究还相对较少，因此，本文研究设计实验，建立胰腺癌大鼠模型，并使用奥曲肽进行干预，结果显示，使用奥曲肽进行干预之后，胰腺癌模型大鼠肿瘤体积、重量出现下降，且奥曲肽剂量越大，肿瘤体积、重量下降幅度越明显，说明奥曲肽能够抑制胰腺癌组织生长，且具有一定的剂量依赖性。

表4 各组大鼠细胞周期蛋白PTEN、p-Akt、mTOR表达水平对比

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量奥曲肽组比较，△P<0.05；与中剂量奥曲肽组比较，☆P<0.05

图3 PTEN、p-Akt、mTOR表达WB图

本文研究中对胰腺癌模型大鼠肿瘤细胞凋亡情况进行检测，结果显示，使用奥曲肽进行干预后，大鼠肿瘤细胞凋亡率出现上升，说明胰腺癌细胞凋亡速度加快，可能是因为奥曲肽对细胞凋亡相关通路进行干预，从而起到诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。有学者在研究中表示，PI3K/Akt/Bcl-2通路蛋白的表达与细胞凋亡密切相关[13]。Bcl-2是在线粒体通路中起着调节作用的一种重要基因，也是细胞的抑制与凋亡过程中比较重要的基因，当Bcl-2的表达水平下降时，与其相关的Bax表达水平便会随之升高，能够起到促进组织细胞凋亡的作用，许多抗肿瘤药物就是通过对Bcl-2表达进行抑制来达到治疗目的[14]。PI3K是一种磷脂酰肌醇3激酶，能在机体生长因子的作用下集成细胞膜[15]。Akt是在处于PI3K下游的靶蛋白，将它激活后，即激活其他靶蛋白，能促使细胞生长，具有抗凋亡的作用[16]。本文研究中对PI3K/Akt/Bcl-2通路相关蛋白表达情况进行检测，结果显示，相比正常大鼠，胰腺癌模型大鼠Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量较高，使用奥曲肽进行干预后，Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量受到调控而出现明显的下调，说明奥曲肽可能是通过调控PI3K/Akt/Bcl-2通路相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt的表达而发挥促进胰腺癌大鼠癌组织细胞凋亡的作用。

本文研究中还对胰腺癌模型大鼠肿瘤细胞周期分布情况进行检测，结果发现，使用奥曲肽进行干预后，胰腺癌模型大鼠肿瘤细胞周期分布情况受到明显的调控，出现这一情况的原因可能是奥曲肽调控细胞周期相关通路，进而改善胰腺癌细胞周期。大量实验研究表明，PTEN、p-Akt、mTOR的表达与细胞周期分布情况密切相关[17-19]。徐萍[20]等在研究中表示，使用药物对胰腺癌细胞进行干预，能够调控周期相关蛋白PTEN、p-Akt、mTOR的表达，进而改善胰腺癌细胞周期分布。本文研究结果显示，使用奥曲肽进行干预后，胰腺癌模型大鼠PTEN表达出现上调，p-Akt、mTOR表达出现下调，说明奥曲肽能够通过调控细胞周期相关蛋白PTEN、p-Akt、mTOR的表达，从而改善胰腺癌大鼠肿瘤细胞周期分布情况，起到阻滞细胞周期的作用。

综上所述，使用较高剂量奥曲肽对胰腺癌模型大鼠进行干预，能够使大鼠肿瘤体积、重量下降，调控细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt的表达，从而促进细胞凋亡，抑制炎症反应，为胰腺癌的治疗提供理论帮助。