高效液相色谱-串联质谱法同时测定酒中6种对羟基苯甲酸酯类防腐剂

赵灵芝，黄笑晨，花中霞，秦江芬，杨莉丽，王可，，

（1．河北师范大学化学与材料科学学院，河北 石家庄 050024；2．石家庄市疾病预防控制中心，河北 石家庄 050011）

作为一类常用的防腐剂，对羟基苯甲酸酯（p arabens，PBs）又称尼铂金酯[1]，主要包括对羟基苯甲酸甲酯（methylparaben，MHB）、对羟基苯甲酸乙酯（ethylparaben，EHB）、对羟基苯甲酸丙酯（propylparaben，PHB）、对羟基苯甲酸异丙酯（isoppylparaben，IPHB）、对羟基苯甲酸丁酯（butylparaben，BHB）、对羟基苯甲酸异丁酯（isobutylparaben，IBHB）[2]。与其它类的防腐剂相比较，对羟基苯甲酸酯因具有低毒安全、强杀菌和防腐能力、在较宽的pH 值范围内有良好的抗菌性能[3]，而被广泛应用于食品[4-5]、药品[6-7]、化妆品及个人护理品[8]。尽管如此，研究发现对羟基苯甲酸酯具有一定的雌激素活性和生殖毒性，能够影响内源性雌激素的代谢，导致线粒体功能障碍[9-10]；且相关研究表明其具有一定的内分泌干扰效应，并与男性不育及乳腺癌的发生存在一定关系[11]。目前，我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定了十余种食品中对羟基苯甲酸酯的最大使用限量（以对羟基苯甲酸计）不超过0.25 g/kg，经表面处理过的新鲜水果及蔬菜不超过0.012 g/kg。

迄今为止，食品中对羟基苯甲酸酯的检测方法主要包括气相色谱法（gas chromatography，GC）[12-13]、胶束电动毛细管电泳色谱法（micellar electrokinetic capillary electrophoresis chromatography，MECC）[14]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15]、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16]等。其中，相比于其它几种检测方法，LC-MS/MS法具有灵敏度高、定性定量准确、可实现多种物质痕量测定等优点，在多分析物检测方面应用广泛。目前，国内外文献关于食品中对羟基苯甲酸酯的检测多为其中的对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，且检测对象主要包括了调味品、酱腌菜、即食食品、鲜水果及果蔬汁，而关于酒中6 种对羟基苯甲酸酯的检测研究还未见报道。因此，本试验通过对前处理方法、色谱条件和质谱参数的优化，建立了高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 同时测定酒中6 种对羟基苯甲酸酯的检测方法，旨在为开展酒中防腐剂的检测及风险评估，加强质量监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 材料与试剂

MHB、IPHB、PHB（纯度均大于 98.0 %）：德国 Dr.Ehrenstorfer 公司；IBHB（纯度 99.0%）：日本东京化学试剂公司；BHB（纯度99.0%）：天津科密欧化学有限公司；EHB（纯度大于99.0%）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯）：美国Fisher 公司；甲酸、甲酸铵（色谱纯）：美国Dikma 公司；试验用水为Milli-Q 超纯水。所测白酒、红酒、啤酒、黄酒、果酒和米酒样品购于石家庄市区超市。

1.1.2 仪器与设备

Agilent 1200-6410B 高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪（配有ESI 离子源）：美国Agilent 科技有限公司；Mettler-Toledo AE240 电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；C3I 型台式离心机：法国Jouan 公司；MS3 涡旋振荡器：德国 IKA 公司；N-EVAP-111 氮吹仪：美国Organomation 公司；Milli-Q 超纯水机：美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别准确称取适量 MHB、EHB、PHB、IPHB、BHB和IBHB 6 种标准品，用乙腈溶解配制1 g/L 标准储备液，保存于-20 ℃冰箱备用。取适量各标准储备液，用含有25%乙腈的水溶液稀释，得到1 mg/L 的混合标准液。采用空白基质提取液稀释，配制 5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L 系列混合标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

准确称取2.0 g（精确至0.01 g）样品于50.0 mL 离心管中，分别加入1.0 mL 2 mol/L 甲酸铵和10.0 mL 乙酸乙酯，涡旋30 s，超声提取5 min，然后加入0.5 g 氯化钠，涡旋混匀，以8 000 r/min 离心5 min。移取乙酸乙酯层，再加入10.0 mL 乙酸乙酯进行二次提取，合并两次提取液并用乙酸乙酯定容至20.0 mL，取2.0 mL 提取液在 45 ℃下氮气吹干。用 1.0 mL 乙腈-水（25 ∶75，体积比）溶解，过 0.2 μm 滤膜，待 HPLC-MS/MS 分析。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×75 mm，2.7 μm）；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流动相：乙腈 -0.1%甲酸（体积分数）水溶液（25 ∶75，体积比）；等度洗脱。

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electrospray ionization source，ESI），负离子扫描模式；干燥气：氮气；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10 L/min；毛细管电压：4 000 v；雾化气压力：103.4 kPa；扫描方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

对羟基苯甲酸酯的结构中含有酚羟基，容易失去H+，以[M-H]-形式存在。因此，选择ESI 负离子模式进行检测。通过全扫描模式得出其母离子[M-H]-，6 种分析物先后通过选择性离子扫描模式得到相对应的碎裂电压，然后通过子离子扫描模式获得定性离子对，同时优化碰撞能。以丰度较大的两个碎片离子作为各对羟基苯甲酸酯的定性离子，其中相对丰度最大的子离子作为定量离子。6 种对羟基苯甲酸酯的质谱参数见表1。

表1 6 种对羟基苯甲酸酯的质谱参数Table 1 MS/MS parameters of 6 PBs

2.2 色谱条件的优化

本试验分别以甲醇-水和乙腈-水为流动相，先后尝试了 XDB-C18，Eclipse plus C18，WCX-1，Poroshell 120 Hilic 及Poroshell 120 EC-C18 5 款色谱柱。结果发现，有机相为乙腈时，6 种化合物的响应信号较高，同时用Poroshell 120 EC-C18 色谱柱分离效果最好，但6种物质仍不能完全分离；向水相中加入0.1%甲酸后，分离效果变好，且以乙腈为有机相，进行等度洗脱，6种目标物可实现完全分离（见图1）。

图1 6 种分析物的混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of 6 analytes

2.3 样品前处理方法的优化

对羟基苯甲酸酯的提取剂多采用乙腈、乙醚，而采用乙酸乙酯的较少。本试验同时选用乙腈、乙醚和乙酸乙酯为提取剂分别进行加标提取比较。试验得到6 种分析物在以乙腈为提取剂时的回收率38.0 %～89.8%；以乙醚为提取剂时的回收率为8.5%～55.7%；以乙酸乙酯为提取时的回收率分别为59.3%～116.2%。结果显示乙酸乙酯的提取效率最好，所以选择提取效率较好的乙酸乙酯为提取剂。

为了进一步提高6 种化合物的回收率，考虑到对羟基苯甲酸酯的结构中含有酚羟基，易电离，因此尝试了向试样中加入酸化剂进行酸化处理。由于盐酸具有强酸性、甲酸铵呈弱酸性并具有一定的缓冲能力，所以选用了0.03 mol/L 盐酸和2 mol/L 甲酸铵进行酸化处理，按照“1.3”前处理方法进行试验。6 种目标物在以盐酸和甲酸铵为酸化剂时的回收率分别为29.1%～88.1%、75.9%～96.2%，在以甲酸铵为酸化剂进行酸化处理时整体回收率较高，最终选用2 mol/L 甲酸铵进行酸化。

2.4 基质效应

基质效应（matrix effect，ME）是指基质成分和目标分析物以外的其他成分对待测物测定值的影响，使用ESI 模式检测时，基质主要影响目标化合物的离子化，使其响应信号增强或减弱，从而形成基质增强或抑制效应[17-18]。试验采用同一质量浓度待测物在基质液与溶剂中峰面积的比值评价基质效应[19]，比值越接近1，则基质效应越小。比值为80%～120%时，表明基质效应较小，可忽略[20]；比值低于80%或高于120%时，表明有较强的基质抑制或增强作用，需用基质匹配标准溶液进行校正。将不含目标物的样品按“1.3”方法进行提取得到基质溶液，比较了质量浓度为10、50、100 μg/L时酒的基质效应，得到ME 为35.6%～66.8%，表明有较强基质抑制效应，因此采用基质标准曲线进行外标法定量分析。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性范围、检出限和定量限

用空白基质提取液配制系列标准溶液，浓度分别为 5、10、20、50 、100、200、500、1 000、2 000 μg/L。以标准溶液质量浓度（X，μg/L）为横坐标，分析物峰面积（Y）为纵坐标，得到相应的线性方程。以空白样品为基质，在测定11 个空白样品的基础上，分别计算得到每种对羟基苯甲酸酯的检出限（limit of detection，LOD，S/N=3）与定量限（limits of quantitation，LOQ，S/N=10）[21-22]。6 种对羟基苯甲酸酯的线性关系、检出限和定量限见表2。

表2 6 种对羟基苯甲酸酯的线性关系、检出限和定量限Table 2 Linear relationship，LOD and LOQ of 6 PBs

由表2可知，6 种对羟基苯甲酸酯在5 μg/L～2 000 μg/L 范围内呈现良好的线性关系，相关系数都可达到 0.999 以上，方法检出限为 0.8 μg/kg～1.1 μg/kg，定量限为 2.9 μg/kg～3.6 μg/kg。

2.5.2 方法准确度与精密度

取酒空白样品，分别按 5、100、1 000 μg/kg 3 个水平浓度进行加标回收试验，每个水平浓度平行测定7次，通过计算得出每种对羟基苯甲酸酯的平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。6 种对羟基苯甲酸酯的平均回收率为76.1 %～108.5 %，RSD 为1.1%～9.1%。表明本方法准确度高，精密度好，能够满足酒中6 种对羟基苯甲酸酯的检测要求，如表3所示。

表3 酒中6 种对羟基苯甲酸酯的加标回收率和相对标准偏差（n=7）Table 3 Spiked recovery and RSD of 6 PBs in wine（n=7）

2.6 实际样品检测

利用本方法对购自石家庄市不同超市的30 份酒样品进行检测，其中包括白酒、红酒、黄酒、啤酒、果酒、米酒各5 份。所测样品中，白酒、啤酒和米酒样品未检出对羟基苯甲酸酯，果酒、红酒、黄酒样品全部检出对羟基苯甲酸乙酯，在果酒中含量为5.5 μg/kg ～13.8 μg/kg；红酒中含量为 6.4 μg/kg ～8.2 μg/kg，黄酒中含量为 5.7 μg/kg ～34.6 μg/kg。此外，在一份黄酒中同时检出了对羟基苯甲酸异丙酯，含量为1.2 μg/kg。参照GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》关于对羟基苯甲酸酯类及其钠盐在调味制品和饮料类制品中的限量标准，所测样品检出值均小于国家限量标准。

3 结论

本试验采用乙酸乙酯为溶剂超声辅助提取，建立了HPLC-MS/MS 同时测定酒中6 种对羟基苯甲酸酯的方法。试验结果表明，6 种对羟基苯甲酸酯在5 μg/L～2 000 μg/L 的质量浓度范围内线性关系良好，检出限为 0.8 μg/kg～1.0 μg/kg、定量限为 3.1 μg/kg～3.6 μg/kg，该方法前处理操作简便、灵敏度高、精密度好、准确度高，适用于酒中6 种对羟基苯甲酸酯的定性定量分析。