干燥方式对柠檬片中游离态、结合态多酚及抗氧化特性的影响

高 炜 张 群 王蓉蓉 李高阳 张菊华 单 杨* 丁胜华*

（1 湖南省农业科学院 长沙410125 2 湖南省农产品加工研究所 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室 长沙410125 3 湖南农业大学食品科技学院 长沙410128）

柠檬（Citrus limon）属芸香科柑橘属常绿小乔木，在地中海沿岸、美洲和东南亚等地均有分布，其主产国为中国、印度、意大利、美国和欧洲南部国家。 它的果实颜色鲜黄，具浓郁香气，富含维生素C、酚酸、类黄酮、类胡萝卜素、柠檬苦素等活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗菌和预防心血管疾病等作用[1]。

干制作为一种传统加工果蔬方法， 能够降低水分活度，防止微生物生长与繁殖，降低内部生化反应速率，从而延长货架期，达到贮藏的目的。 它既是一个降低水分的物理单元操作， 也是发生复杂反应的生化过程[2]。目前国内外关于柠檬干制的研究主要集中在干燥工艺、 干燥动力学及品质变化等方面。 Chen 等[3]研究了不同温度下封闭式太阳能干燥与热风干燥的柠檬片， 结果表明60℃下封闭式太阳能干燥能最大保留柠檬片的品质感官。 Sadeghi 等[4]研究比较了热风、微波以及热风联合微波干燥柠檬片的水分传递特性；Torki-Harchegani 等[5-6]先后研究了柠檬全果在热风干燥过程中的水分传递特性及柠檬片热风干燥动力学模型。 Darvishi 等[7]研究了柠檬的微波干燥特性及颜色变化规律， 发现随微波功率增加柠檬片亮度值与黄蓝值增大，而红绿值减小。Rubio 等[8]研究了塔格糖、异构蔗糖、低聚果糖和甜菊水4 种甜味剂对柠檬片渗透脱水的影响，结果表明：柠檬片水分有效扩散系数最大的是低聚果糖和甜菊水处理组，总质量损失最大的是异构蔗糖处理组。酚类物质作为柠檬中的重要次生代谢物，具有抗氧化、抗遗传毒性等功效。 Barreca 等[9]从地中海甜柠檬中检出8 种黄酮， 并发现甜柠檬汁具有较强的抗氧化能力。 Wang 等[10]在台湾地区柠檬中检出3 种黄烷酮、3 种黄酮和3 种黄酮醇。 本文以我国常见的黄柠檬尤力克为材料， 采用分光光度计法和超高效液相色谱分别对其总酚、 抗氧化能力及酚类物质进行定性和定量分析， 为柠檬资源开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜成熟的尤力克黄柠檬，购于四川安岳县，选择大小均一， 无机械伤和无病虫害的柠檬作为试验原料。 甲醇，色谱纯，购自美国Tedia 公司；2，4，6-三吡啶基三嗪 （TPTZ）、2，2-联氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS+）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Folin 酚、胃蛋白酶、胰液素， 购自Sigma-Aldrich 上海贸易有限公司；酚酸标准品：原儿茶酸、香草酸、丁香酸、新绿原酸、绿原酸、香豆酸，购自成都曼斯特生物科技有限公司；黄烷酮、黄酮和多甲氧基黄酮标准品：牧荆苷、芦丁、野漆树苷、木犀草素、花旗松素、圣草枸橼苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、枸橘柑、香叶木素、 川陈皮素和芹菜素购自成都爱思特生物科技有限公司； 甜橙黄酮和桔红素购自Sigma-Aldrich（上海）科技有限公司；枸橘苷购自上海远慕生物科技有限公司；甲醇、浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钾、氯化钠、没食子酸，分析纯，购自国药集团。

1.2 仪器与设备

LGJ-25C 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；DHG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备厂；SAK-505 红外烘干，泰州圣泰科红外科技有限公司；ZF-6050 真空干燥箱，上海捷呈实验仪器有限公司；Avanti J-26XP 冷冻离心机， 美国Beckman 公司；T6 紫外分光光度计， 北京普析通用有限责任公司；Acquity UPLC 超高效液相色谱仪，美国Waters 公司；多功能切片机，北京美科达科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 分选出单果质量为100 g 左右的柠檬，清洗去污。采用不锈钢水果刀切除两端尖， 中间部分利用多功能切片机切分成4～5 mm厚度的切片，收集备用。

1.3.2 柠檬片干燥 柠檬片（1 kg）单层整齐铺放在筛网上，通过下述4 种干燥方式进行干燥，终点湿基含水量为7%。 冷冻干燥 （Freeze drying，FD）： 冷阱温度≤-60 ℃， 物料温度-60 ℃预冻6 h，升温速率4 ℃/2 h，四层冻干面积0.25 m2，真空度≤10 Pa； 热风干燥（Air drying，AD）： 温度60℃，容积400 mm×400 mm×300 mm，风速恒定1 m/s；红外干燥（Infrared drying， IRD）：温度60 ℃，容积400 mm×300 mm×200 mm， 风速可调1 m/s左右，加热管功率225 W；真空干燥（Vacuum drying）： 温度60 ℃， 容积415 mm × 370 mm × 345 mm，真空度1 kPa。 收集干制柠檬片于密封袋中，4 ℃平衡水分24 h， 后置于在万能粉碎机中粉碎，并过60 目筛，收集样品，-20 ℃密封保存备用。

1.3.3 游离态与结合态多酚的制备 准确称取柠檬粉1.5 g 于50 mL 离心管，加入23 mL 80%的甲醇， 于30 ℃，250 W 条件下超声提取30 min，4 ℃10 000×g 离心10 min，收集上清液。 重复上述步骤，合并上清液后，用80%甲醇定容至50 mL，混匀0.2 μm 滤膜过滤， 用于游离态多酚与酚类物质、抗氧化能力的测定[11]。 收集沉淀物于50 mL 防爆螺旋瓶，加入浓硫酸/甲醇 （V ∶V=1 ∶9）溶剂40 mL，密封后置于80 ℃水浴锅中水解12～14 h。 真空抽滤后， 滤液用80%的甲醇溶解残留并定容至50 mL，混匀0.2 μm 滤膜过滤，用于结合态多酚与酚类物质、抗氧化性活性的测定[12]。

1.3.4 多酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteus[11]法。 取提取液0.4 mL， 加入2 mL 稀释10 倍的Folin 酚试剂后混合均匀，5 min 后加入10%的碳酸钠溶液3 mL， 混合均匀常温放置2 h， 于765 nm 处测定吸光值，以80%甲醇为对照。 样品中的酚类含量以每克干质量含毫克没食子酸表示（mg GA/g DW）。

1.3.5 抗氧化能力测定 清除DPPH·能力采用分光光度计法进行测定[11]：取0.4 mL 的提取液加入3.5 mL 0.14 mmol/L DPPH·溶液， 混匀后于室温下避光静置30 min， 测定其在517 nm 的吸光值。 以不加样品的DPPH·溶液做对照， 以Trolox试剂作为标准品， 绘制标准曲线， 样品的清除DPPH·能力以每克干质量含毫克Trolox 表示（mg Trolox/g DW）。

清除ABTS+能力测定[11]：将ABTS+溶解于20 mmol/L、pH 4.5 的醋酸盐缓冲液中得到7 mmol/L的ABTS·+贮液， 取5 mL 7 mmol/L ABTS·+与5 mL 2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液混合， 在室温下避光反应12～16 h，使溶液达到稳定的氧化态。 取3.6 mL ABTS·+工作液和0.4 mL 不同浓度的测试液混合，于暗处反应30 min，以80%甲醇为对照，分别测定734 nm 处的吸光值， 计算清除率。 以Trolox 试剂作为标准品，绘制标准曲线，样品的清除DPPH 自由基能力以每克干质量含毫克Trolox表示（mg Trolox/g DW）。

铁离子还原能力（FRAP）的测定[11]：取100 μL的提取液于离心管中并加入4 mL TPTZ 工作液（该工作液由25 mL pH 3.6 的醋酸缓冲液、2.5 mL 10 mmol/L 的TPTZ 溶液和2.5 mL 20 mmol/L FeCl3组成， 其中TPTZ 用40 mmol/L 盐酸溶解定容）于37 ℃水浴中反应10 min，以80%甲醇为参比，测定593 nm 处的吸光值。 以VC 为标准品，绘制标准曲线， 样品的FRAP 能力以每克干质量含毫克VC 表示（mg Vc/g DW）。

1.3.6 酚类物质的测定 参考丁胜华等[13]报道的UPLC 方法，略作修改后对柠檬中的酚类物质进行检测。 通过对比标准物质的保留时间以及添加标准物质到样品中判定可疑峰， 进行样品酚类物质的定性。 UPLC 条件： 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）；流动相：0.5%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱程序如表1；流速：0.3 mL/min，柱温：35℃；进样体积：2.0 μL； 苯甲酸型酚酸和黄烷酮的检测波长为283 nm，黄酮、多甲氧基黄酮与肉桂酸型酚酸的检测波长330 nm，采用外标法进行样品的定量，样品中多酚含量以毫克每克干质量计（mg/100 g DW）。

表1 流动相洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.4 数据统计与分析

采用Origin 8.0 统计分析试验数据， 计算标准偏差；数据结果以平均值±标准差表示；并进行单因素方差分析，采用t 检验和双尾检验。 当P<0.05 时，表示显著差异；当P<0.01 时，表示极显著差异。

2 结果与分析

2.1 干燥方式对柠檬片游离态及结合态多酚总含量的影响

FD、AD、IRD 及VD 的柠檬片中游离态及结合态多酚总含量的影响如表2 所示。由表2 可知，与FD 处理相比，AD 处理柠檬片中游离态和结合态总量无显著差异（P＞0.05），而IRD 和VD 处理其含量显著下降（P＜0.05）， 且VD 处理组含量最低，比FD 处理组低16%。 柠檬中结合态多酚均高于游离态多酚， 是游离态多酚的1.55～2.14 倍。Aydin 和Gocmen[14]也发现南瓜中的结合态多酚含量均高于游离态多酚含量。 与FD 相比，IRD 处理的柠檬中游离态多酚显著增加（P＜0.05），而与AD和VD 处理组差异均不显著（P＞0.05）；而对于结合态多酚， 与FD 相比，AD、IR 和VD 处理的柠檬中结合态多酚含量显著降低（P＜0.05）。 AkdaS和BaSlar 研究了真空干燥和热风干燥过程中总酚含量降解动力学， 结果表明酚类物质在真空干燥下比热风干燥降解得更快， 主要是因为干燥过程中酚类物质发生热降解[15]。

表2 干燥方式对柠檬片中游离态、结合态及其总酚、可被生物利用多酚及其生物利用度的影响Table 2 The contents of free， bound， and total phenols of lemon slices dried by different dehydrated methods

2.2 干燥方式对柠檬片中游离态与结合态多酚抗氧化性的影响

不同干燥方式对柠檬片中游离态与结合态提取液的清除ABTS·+、DPPH·与FRAP 能力如图1所示。 从图1a 可知，不同干燥处理的柠檬中游离态多酚清除ABTS·+能力均高于其结合态多酚，前者是后者的14.0～15.5 倍； 其中IRD 处理组游离态多酚清除ABTS·+能力最高，VD 处理组最低；与FD 处理相比，IRD 和AD 处理组游离态多酚清除ABTS·+能力显著上升（P＜0.05），而VD 处理组显著下降（P＜0.05）。 AkdaS研究了真空干燥和热风干燥柑橘片过程中抗氧化能力降解动力学， 发现酚类物质在真空干燥下比热风干燥降解得更快，且酚类物质是柑橘片中的主要抗氧化物质[15]。 类似的，不同干燥处理柠檬中游离态多酚的FRAP 均高于结合态多酚图1c； 与FD 处理相比，IRD 和VD 处理组游离态多酚的FRAP 显著下降（P＜0.05），AD 处理组则未发生显著变化 （P＞0.05）；FD、AD与IRD 处理组间的结合态多酚的FRAP 均无显著差异（P＜0.05），但均分别高于VD 处理组（P＞0.05）。 然而，不同干制处理柠檬其游离态多酚清除DPPH·能力均低于结合态多酚； 与FD 处理相比，AD、IR 和VD 处理游离态多酚清除DPPH·能力显著下降， 而与AD、IRD 处理组结合态多酚清除DPPH·能力则无显著差异。 Esparza-Martínez等[12]发现酸橙皮结合态多酚清除DPPH·能力均高于游离态多酚， 且鲜酸橙皮经60 ℃或90 ℃热风干燥其游离态多酚清除DPPH·能力显著降低，而结合态多酚清除DPPH·能力未发现显著变化。

图1 干燥方式对柠檬片中游离态和结合态提取液清除ABTS·+能力（a）、清除DPPH·能力（b）FRAP（c）的影响Fig.1 Antioxidant capacity in different dried lemon slices （a）ABTS·+ （b）DPPH· （c）FRAP

2.3 干燥方式对柠檬片中游离态与结合态酚类物质种类及含量的影响

按照表1 流动相洗脱程序， 对FD、AD、IR 及VD 的柠檬片中游离态多酚和结合态多酚进行酚类物质检测，21 种酚类标准物质及4 种干柠檬片的游离态多酚和结合态多酚的UPLC 图如图2 ～图3 所示。21 种酚类物质包括：3 种苯甲酸型酚酸（原儿茶酸、香草酸、丁香酸）、3 种肉桂酸型酚酸（新绿原酸、绿原酸、香豆酸）、6 种黄酮（牧荆苷、芦丁、野漆树苷、木犀草素、芹菜素、香叶木素）、6种黄烷酮（花旗松素、圣草枸橼苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、枸橘苷）和3 种多甲氧基黄酮（甜橙黄酮、川陈皮素和桔红素）。

图2 21 种酚类物质在283 nm 和330 nm 处的超高效液相色谱图Fig.2 Chromatograms of 21 kinds of phenolics at 283 nm and 330 nm

图3 柠檬游离态和结合态多酚在283 nm 与330 nm 处的色谱图Fig.3 Chromatograms of free and bound phenolics in lemon at 283nm and 330 nm

通过对比每个标准品与样品中色谱峰的保留时间，对其进行酚类物质定性，其定量结果如表3所示。 在FD、AD、IRD 及VD 的柠檬片中，分别检出13，13，14 和14 种游离态多酚， 涉及到2 种苯甲酸型酚酸、3 种肉桂酸型酚酸、5 种黄酮、6 种黄烷酮； 其中12 种多酚在4 种干燥柠檬中均有检出，香豆酸和牧荆苷仅在VD 处理组检出，木犀草素仅在IR 处理组检出；而柠檬中游离态多酚中均未检出多甲氧基黄酮。除FD 处理组结合态酚酸总量高于结合态类黄酮总量外，4 种干燥柠檬中，无论是游离态或结合态， 其类黄酮总量均远高于酚酸总量， 这表明柠檬中主要酚类物质为类黄酮。FD、AD 和IRD 处理组游离态多酚含量以橙皮苷为最高（924.42～1 338.19 mg/g DW），占柠檬游离酚类物质总量的48.67%～55.40%， 其次是圣草枸橼苷和芦丁， 而VD 处理组游离态多酚含量以圣草枸橼苷含量为最高（536.88 mg/g DW），占柠檬游离酚类总量的42.56%， 其次是橙皮苷和芦丁。李利改等[16]在4 号柠檬中也检出橙皮苷和圣草枸橼苷，但未检出其它酚类物质；Barreca 等[9]在地中海甜柠檬中鉴定出了8 种类黄酮， 包括新西兰牡荆甙Ⅱ、路赛宁-2 4’-甲基醚、圣草枸橼苷、金雀花素、荭草素-4’-甲基醚、野漆树苷、地奥司明和橙皮苷， 其中橙皮苷含量最高， 其次为圣草枸橼苷。 本文中检出的游离态多酚主要多酚与已有报道结果相同， 但其它多酚种类及含量存在较大差异，这些差异可能与生长地域、品种以及加工方式的不同相关。

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从表2 可知，FD、AD、IRD 及VD 处理柠檬中分别检出12，13，11 和11 种结合态酚类物质，包括2 种苯甲酸型酚酸、1 种肉桂型酚酸、3 种黄酮、5 种黄烷酮、3 种多甲氧基黄酮， 其中川陈皮素仅在AD 处理组检出。4 种干燥处理柠檬中结合态多酚含量均以原儿茶酸为最高（208.03～359.20 mg/g DW）， 占柠檬结合态酚类物质总量的34.14%～53.30%，其次为柚皮苷和橙皮苷。柠檬中苯甲酸型酚酸， 原儿茶酸与丁香酸在柠檬中主要以结合态形式存在；肉桂酸型酚酸，新绿原酸、绿原酸和p-香豆酸仅检出游离态形式， 而游离态和结合态香草酸均未检出。 与本文结果不同的是，Russo 等[17]发现柠檬中游离态酚酸含量最高为没食子酸，而原儿茶酸含量相对较低， 且二者只存在于柠檬种子中。 干燥处理对柠檬中游离态和结合态酚酸呈现不同影响。 与FD 处理相比，AD、IRD 和VD 处理组其游离态原儿茶酸含量显著升高， 而其结合态原儿茶酸含量显著下降。 这可能是由于热处理导致原儿茶酸由结合态转变成游离态。然而，热处理导致结合态和游离态丁香酸含量均分别显著降低。对于肉桂型酚酸，与FD 相比，除VD 处理导致游离态新绿原酸含量显著下降外， 其余热处理均分别导致游离态新绿原酸和绿原酸含量显著上升。 Xu 等[18]在研究热处理对柑橘皮中多酚类物质的影响时发现热风120 ℃处理柑橘皮后， 其游离态肉桂酸型酚酸，p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量均下降，而游离态苯甲酸型酚酸，p-羟基苯甲酸和香草酸含量均上升； 同时结合态的肉桂酸型和苯甲酸型酚酸均呈现下降趋势。 4 种干燥柠檬中，共检出芦丁、野漆树苷、香叶木素和木漆草素4 种黄酮，其中芦丁主要以游离态存在，而野漆树苷与香叶木素主要以结合态存在； 其中热处理导致游离态芦丁与香叶木素含量显著下降， 而游离态野漆树苷含量显著上升。 在红枣与橙皮热风干燥过程中也发现游离态芦丁含量均显著下降[12，20]，而金柑在热风110 ℃处理1.5 h 后其游离态野漆树苷含量显著增加[20]。4 种干燥处理的柠檬中均检出丰富的黄烷酮，包括花旗松素、圣草枸橼苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、枸橘苷，其中花旗松素仅以游离态存在， 其余5 种黄烷酮均以游离态和结合态存在；橙皮苷和圣草枸橼苷主要以游离态存在，柚皮苷主要以结合态存在。 Esparza-Martínez 等[12]在酸橙下脚料中也检出了结合态和游离态的橙皮苷、圣草枸橼苷、柚皮苷和柚皮素，但其圣草枸橼苷和柚皮苷主要以结合态存在。 出现这种差异可能与柑橘品种以及柑橘原料的部位的差异导致。热处理对于游离态黄烷酮主要以热降解为主，比如， 与FD 处理相比，VD 处理导致游离态橙皮苷和圣草枸橼苷含量分别下降了64.25%和26.21%。不同干燥处理柠檬中均检出甜橙黄酮、 橘红素2种多甲氧基黄酮均仅以结合态存在，与FD 相比，热处理干燥柠檬其结合态甜橙黄酮和橘红素含量均显著升高。

2.4 干燥方式对柠檬片中总酚、总酚酸、总类黄酮含量以及抗氧化能力之间的相关性

为了评价4 种柠檬片中总酚、总酚酸、总类黄酮含量以及ABTS·+、FRAP、DPPH·之间的相关性，进行双尾检验其结果如表4 所示。 结果表明：不同干燥方式的柠檬片总酚与总类黄酮有极显著性的正相关性，与总酚酸有极显著性的负相关性，这与表4 中总酚酸及总类黄酮的含量的结果一致； 同时总酚和总类黄酮含量分别与ABTS·+、FRAP 呈现极显著的正相关性，与DPPH 有显著性的负相关性；其中ABTS·+抗氧化能力与FRAP 还原能力呈现极显著的正相关性， 这表明不同干燥处理的柠檬中， 发挥抗氧化作用的主要是类黄酮物质。这与Aydin 等[14]研究的南瓜粉游离态与结合态提取液的抗氧化能力相似， 总类黄酮和总酚含量与ABTS·+、FRAP 呈正相关性。

表4 不同干燥方式的柠檬片总酚、总酚酸、总类黄酮含量以及ABTS+、FRAP、DPPH·之间的相关性Table 4 The correlation of between content of total phenolics， total phenolic acids， total flavonoids，and ABTS+， FRAP， DPPH·in different dried lemon slices

3 结论

AD 处理组柠檬游离态和总酚含量最接近FD处理组； 不同干燥处理的柠檬中游离态多酚清除ABTS+自由基能力和铁离子还原能力均分别高于其结合态多酚， 而其游离态多酚清除DPPH 自由基能力均低于结合态多酚。 不同干燥柠檬中类黄酮含量显著高于酚酸含量， 柠檬中的主要酚类物质是类黄酮；柠檬其游离态多酚主要为橙皮苷、圣草枸橼苷和芦丁；结合态多酚主要为原儿茶酸、柚皮苷和橙皮苷。 热处理对柠檬中的酚类物质呈现不同影响。 与FD 处理相比，热处理导致柠檬中结合态总酚酸含量下降，游离态总酚酸含量上升；而结合态总类黄酮含量上升， 游离态总类黄酮含量下降， 其中3 种热处理干燥方式中，AD 处理组总酚酸含量和总类黄酮含量均为最高。