实时CEUS评估甲状腺乳头状癌侵袭性及其与病理微血管密度的关系

周 易，梁 蕾，孟晓暄，卢一艳，郭 君

(北京大学航天临床医学院 航天中心医院超声科，北京 100049)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤[1]。目前超声是评估甲状腺肿瘤的首选影像学方法，能够全面评价甲状腺结节的位置、大小、形态和性质，且实时CEUS还能进一步反映肿瘤微循环灌注情况。病理微血管密度(microvessel density， MVD)是常用的量化及预测肿瘤血管生成的指标[2]。本研究探讨PTC的CEUS特征及其与病理MVD的关系，旨在为评估PTC的侵袭性提供影像学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1—12月在我院接受诊治并经病理证实的52例PTC患者，男17例，女35例，年龄19～84岁，平均(42.7±12.9)岁。所有患者均接受手术切除+颈部淋巴结清扫，并根据病理检查淋巴结结果分为转移组(n=28)和未转移组(n=24)。

1.2 仪器与方法

1.2.1 超声检查 采用Philips iU22彩色超声诊断仪，L9-3探头，频率3～9 MHz。嘱患者仰卧，充分暴露颈部。首先行二维超声检查，观察甲状腺结节的位置、大小、形态、边界、纵横比、内部回声、后方回声、有无钙化及与被膜接触程度等；对可疑恶性结节行CEUS，选择脉冲反相谐波造影条件，机械指数0.07，造影剂采用声诺维，剂量2.4 ml，经肘静脉团注，随后注入5 ml生理盐水。嘱患者在注入造影剂后保持体位，不移动、不说话、勿吞咽；在注射造影剂的同时启动图像采集，选择病灶最大纵切面，观察甲状腺病灶在160 s内的回声变化。

1.2.2 实时CEUS定量分析 采用QLAB定量分析软件对甲状腺ROI进行动态分析，分别在结节中心区与周边区放置取样框，以结节最大径的内1/2类圆形区域为结节中心区，剩余环形区域为结节周边区，然后描记结节轮廓；如结节与周围正常组织分界不清或结节呈分叶状，则以分界清楚部分确定最大径，或包括分叶在内选定最大径。软件自动获得甲状腺病变各部分血流灌注时间-强度曲线及定量参数，包括达峰时间(time to peak, TTP)、峰值强度(peak intensity, PI)、AUC以及拟合曲线上升支斜率和下降支斜率。

1.2.3 MVD计数方法 手术切除标本均以10%甲醛溶液固定，常规处理后石蜡包埋，厚度4 μm连续切片，600℃烘烤过夜,并分别进行HE和免疫组织化学染色。采用EnVision两步法进行CD34免疫组织化学染色。

本研究在Weidner计数方法的基础上，采用Tissue FAXS PLUS(Tissue Gnostics GmbH)全景组织细胞定量分析系统进行甲状腺CD34免疫组织化学切片图像采集和病灶内MVD分析。以Tissue FAXS软件自动识别组织区域，利用20倍物镜对全玻片免疫组织化学图像进行多视野(单视野面积0.23 mm2)自动成像和图像自动无缝拼接，最终获取200倍组织全景图及细胞解析度图像；然后利用Strata Quest(Tissue Gnostics GmbH)软件对结节中心和周边区域(选择方法同上)MVD进行分析，获得MVD计数。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，对转移组与未转移组间、结节中心与结节周边采用t检验比较。采用Pearson相关分析评价病理MVD与CEUS指标的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC中CD34的表达 PTC中，多数CD34阳性血管内皮细胞位于乳头的纤维血管轴心，呈节段性分布，滤泡亚型PTC常见微血管位于滤泡之间的间质中；肿瘤内坏死纤维区域多无阳性血管内皮细胞，纤维结缔组织呈非特异性着色，与背景分界不清；肿瘤周边血管分布较密集，部分癌巢呈浸润性生长，与周围正常甲状腺组织分界不清，也可呈非特异性着色(图1、2)。

2.2 MVD比较 52例PTC中MVD分布不均，结节总体MDV计数平均值为(276.81±95.49)个/mm2，结节周边区MVD计数平均值[(296.94±107.72)个/mm2]高于中心区平均值[(256.68±92.08)个/mm2]，差异有统计学意义(t=0.024,P=0.041)。转移组结节周边MVD计数高于未转移组(P=0.039)，2组结节中心区MVD计数差异无统计学意义(P=0.200)，见表1。

表1 转移组与未转移组PTC患者MVD计数比较(个/mm2，±s)

表1 转移组与未转移组PTC患者MVD计数比较(个/mm2，±s)

组别结节中心结节周边转移组(n=28)272.78±98.26325.80±103.57 未转移组(n=24)230.58±74.33 249.64±89.03 t值1.3102.159P值0.2000.039

2.3 CEUS定量参数与MVD的相关性 结节周边区时间-强度曲线AUC与结节周边区、结节总体MVD计数呈正相关(r=0.45、0.41，P均<0.05)，余参数间均未见明显相关性，见表2。

3 讨论

常用MVD计数方法中，需避开肿块内出血、坏死及液化区域，计数肿瘤内“热点”的血管密度(high-MVD， hMVD)；但肿瘤周边与正常组织接触区域肿瘤生长活跃，新生血管丰富，肿瘤中心常发生坏死纤维

表2 PTC的CEUS定量参数与MVD计数的相关性

图1 PTC患者，男，33岁，未转移组 A.二维超声示甲状腺右叶中部低回声结节，边界清，形态规则； B.CEUS呈低增强； C.结节CD34染色全景图像示结节中心区及周边区可见多发坏死及纤维化区域(CD34染色，×10)； D.结节内微血管呈特异性棕黄色染色，结节中心区MVD计数为85.88个/mm2，周边区为99.93个/mm2(CD34染色，×200) 图2 PTC患者，女，47岁，转移组 A.二维超声示甲状腺右叶低回声结节，边界欠清，形态不规则，内可见点状钙化； B.CEUS呈等增强； C.结节CD34染色全景图像显示结节微血管丰富(CD34染色，×10)； D.结节内微血管呈特异性棕黄色染色，结节中心区MVD计数为395.55个/mm2，周边区为417.71个/mm2(CD34染色，×200)

化，血供减少，且局部区域的MVD难以反映肿瘤的整体微血管灌注。本研究在既往MVD计数方法的基础上，运用Tissue FAXS PLUS全景组织细胞定量分析系统，使计数区域与肿瘤CEUS分析区相对应，在同一计数标准下分别获得肿瘤中心区与周边区域整体MVD计数，能更加真实地反映肿瘤微血管的生成情况。

CEUS评估肿瘤内MVD已广泛用于肝脏肿瘤、前列腺癌、肾脏肿瘤等方面，且CEUS特征及定量参数与MVD具有相关性[3-6]。Du等[7]认为乳腺病变中高MVD组与低MVD组的CEUS模式不同，高MVD组的CEUS表现为非均匀增强伴有灌注缺损。本研究也发现PTC结节MVD不均，周边区MVD计数高于中心区，同时转移组结节周边MVD计数高于未转移组。其原因可能是肿瘤新生毛细血管由肿瘤周围宿主组织原有小血管壁发出，并由外向内生长，肿瘤周边细胞增殖活跃，但肿瘤细胞的生长速度快于微血管的形成速度，使中心区域易出现缺血坏死及血管重构，故结节整体MVD有所差异，且结节中心区MVD通常低于结节周边区；而发生颈部淋巴结转移的PTC具有更高的侵袭性，代谢水平更高，周边肿瘤细胞增殖更活跃，微循环灌注更丰富，故转移组周边MVD较未转移组更高，而结节中心MVD无显著性差异。

本研究发现PTC结节周边区、结节总体MVD计数与结节周边区时间-强度曲线的AUC呈正相关(r=0.45、0.41，P均<0.05)。Liu等[8]同样发现乳腺癌CEUS周边强化组的肿瘤周边MVD明显高于非周边强化组。Kabakci等[9-12]认为肿瘤CEUS定量分析时间-强度曲线中的AUC参数与肿瘤MVD相关。肿瘤内微血管形成是CEUS的基础，时间-强度曲线的AUC反映造影剂进入ROI的总体情况，代表病变内ROI的平均血流量，能够反映肿瘤微循环灌注情况。因此，PTC结节不同部位的MVD和相应部位的CEUS定量参数能够更准确地反映肿瘤真实微循环情况，结节周边区时间-强度曲线的AUC与结节周边MVD具有相关性。

总之，CEUS定量分析对评估PTC的侵袭性具有重要价值；病理MVD可为评价PTC的侵袭性提供病理学依据。

(致谢：衷心感谢Tissue Gnostics China Division提供的全景组织细胞定量分析系统对课题的支持，诚挚感谢庄新品博士在微血管密度MVD计数中对课题的帮助。)