单味中草药提取物对猪源沙门氏菌的抑菌效果

倪吉荣

摘  要：本试验旨在探讨黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草五种中草药对猪源沙门氏菌的抑菌效果。试验制备黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草五种中草药提取物后，采用牛津杯法测定五种中草药提取物对猪霍乱沙门氏菌的抑菌作用，并采用梯度稀释法测定其最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），观察其对沙门氏菌的体外抑制作用。结果表明，空白对照组无抑菌圈，阳性对照组抑菌圈直径为（20.13±1.47）mm;与对照组相比，苦参、黄芪组抑菌作用差异显著（P>0.05），敏感程度均为高敏;黄连、黄柏、甘草组的差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），敏感程度为高敏或中低敏;黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草五种中草药的MIC浓度分别为20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。试验显示，黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草五种中草药均可一定程度地抑制猪源沙门氏菌，苦参抑制作用最强，与抗生素效果一致，其次分别为黄芪、黄连、黄柏、甘草。

关键词：单味中草药;猪源沙门氏菌;抑菌效果

中图分类号：S816.7 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）06-0024-03

沙门氏菌寄生于人类和动物肠道内，属于革兰氏阴性杆菌，是一种常见的人兽共患病病原菌，它不仅能导致仔猪副伤寒、母猪流产等动物性症状，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、肠胃炎和食物中毒[1]。猪沙门氏菌病又称猪副伤寒，致病菌主要有猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等，常发生于6月龄以下仔猪，以1～4月龄仔猪多发，临床上常表现为急性（败血症）、亚急性和慢性三种类型，其中急性病死率达90%以上，慢性病死率达25%～50%，给养猪业造成了巨大的经济损失[2]。据临床试验研究，引起猪沙门氏菌病的主要病原菌为猪伤寒沙门氏菌，传统抗生素的广泛应用虽然控制了沙门氏菌的传播，但也存在着极为严重的安全隐患，导致了细菌耐药性增强、畜产品抗生素残留等问题，影响着猪沙门氏菌病的治疗效果和畜产品质量安全，对人体健康也造成了极大的影响[3]。

中草药作为我国传统药材，多系天然植物成分，具有抗菌、抗病毒、抗毒素、免疫調节等作用，且不易残留、毒副作用小，具有西药无法比拟的优势[4]。但是，目前在中药提取物对猪源沙门氏菌的抑菌效果的研究中，多见于复方中药制剂对猪沙门氏菌病的治疗效果评价，对于单味中药提取物对猪源沙门氏菌病抑菌效果的评价研究较少，致使中药提取物的临床应用缺乏一定的依据。本文就单味中草药对猪源沙门氏菌的抑菌效果进行分析，结果表明黄连等五种中草药对猪源沙门氏菌有一定的抑制作用[5]，苦参抑制作用最强，且与抗生素效果一致，其次分别为黄芪、黄连、黄柏、甘草。

1  材料与方法

1.1 试验材料

黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草购自毫州市林中森药业销售公司。硫酸庆大霉素购自杭州微生物试剂有限公司。猪霍乱沙门氏菌（NEAU0452）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心[6]。营养琼、酵母浸粉脂和琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司，牛肉浸膏和蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂，营养肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2  研究方法

1.2.1 提取物的制备

黄连单味药提取物的制备：称取一定质量的经粉碎处理的黄连，按料液比1∶10加入蒸馏水浸泡30 min，然后用超声清洗仪处理  20 min，再用电炉加热至沸，保持微沸1 h，过滤后加入等量蒸馏水，保持微沸20 min，过滤，将两次滤液合并，转至60 ℃水浴锅浓缩至0.5 g/mL。其余四种中药提取制备同黄连。

1.2.2 各提取物抑菌效果的测定与评判

试验分为空白对照组、阳性对照组、各单味中草药组，空白组即为蒸馏水200 μL给药，阳性对照组为硫酸庆大霉素10 μg/mL给药，各单味中草药组分别以0.5 mg/mL给药[7]。

抑菌作用评定采用牛津杯法。将待试细菌制成细菌混悬液，调菌落总数为106 CFU/mL，用灭菌棉签在平皿培养基表面均匀涂布细菌混悬液[8]。采用无菌操作将经过高压灭菌处理的牛津杯垂直放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基紧密接触，随后进行给药，每种菌做5个平行[9]。加满后置37 ℃培养    16 h～18 h，观察牛津杯孔周围是否有透明圈，用游标卡尺直接测量其大小，记录数据。判断标准如下：抑菌圈直径≥20 mm为高敏，抑菌圈直径在15 mm～20 mm之间为中敏，抑菌圈直径≤15 mm为低敏，无抑菌圈为耐药[10]。

1.2.3 各提取物对致病菌最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的测定

在试管架上依次排列装有营养肉汤培养基的灭菌试管，在试管中加入一定体积的中草药提取物使培养基与所加中草药提取物溶液总体积为5 mL，制得药物浓度分别为10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、80 mg/mL、160 mg/mL、320 mg/mL和640 mg/mL培养基。向上述所制含不同药物浓度的营养肉汤培养基中分别加入 0.5 mL备用菌液，混匀备用。将各试管置于37 ℃恒温培养20 h。从培养20 h的试管中取出100 μL混合液，均匀涂布于固体LB平板，37 ℃恒温倒置培养24 h后观察结果，以第一个出现稀疏单菌落的平板所对应的药物浓度为最低抑菌浓度[11]。

1.3 数据分析

本研究数据采用SPSS 19.0软件进行分析处理，试验数据均为平均数和标准差。样本独立性采用t检验，数据有效性采用卡方检验。

2  试验结果

2.1 各提取物对猪源沙门氏菌的抑制程度

五种中草药提取物抑菌作用结果见表1。空白对照无抑菌圈，阳性对照抑菌圈直径为（20.13±1.47）mm。与阳性对照组相比，苦参、黄芪组抑菌作用差异不显著（P>0.05），敏感程度均为高敏;黄连、黄柏、甘草组的差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），敏感程度为高敏或中低敏。

2.2 各提取物对猪源沙门氏菌的MIC

表2为各提取物对致病菌MIC的测定结果，五种MIC浓度分别为20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。結果表明，抑菌效果最佳的是苦参，其次分别为黄芪、黄连、黄柏、甘草。

3  讨论

随着土霉素、四环素、磺胺类和喹诺酮类抗生素的广泛使用，细菌耐药性以及药物残留等问题极大地损害了食品质量安全，也威胁着人类健康。因此，寻找安全有效的饲用抗生素替代物是目前畜牧业研究的重要方向，中草药作为传统中医药的瑰宝，具有抗菌、抗病毒、抗毒素、免疫调节、补充营养、提高生产性能等作用，且不易残留、毒副作用小，具有西药无法比拟的优势，在抗生素替代品研究和提高畜禽生产性能上倍受关注，成为了当今畜牧业和饲料业研究的热点[12]。

本研究基于文献的积累筛选了五种中草药，包括黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草，通过制备提取物，分别分析其对猪源沙门氏菌的抑菌效果。黄连清热燥湿、泻火解毒，其主要成分小檗碱对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肺炎链球菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌等均有较强的抗菌作用[13]。苦参苦寒降泻、泻火燥湿、清热解毒，苦参碱可使鸡大肠杆菌菌体变形、细胞质固缩、质壁分离、菌体中央出现空腔，最终引起细菌死亡[14]。黄柏苦寒沉降，清热燥湿、泻火解毒。黄芪可增强机体免疫功能，且具有较广泛的抗菌作用[13]。甘草具有清热解毒的功效，甘草黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、酵母菌、真菌、链球菌等均有抑制作用[15]。

试验结果表明，对照阳性硫酸庆大霉素组，苦参、黄芪组抑菌作用有显著差异，敏感程度均为高敏;黄连、黄柏、甘草组敏感程度为中低敏，且差异显著，具有统计学意义。此外，黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草五种中草药提取物MIC浓度分别为20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。综上所述，黄连、苦参、黄柏、黄芪、甘草五种中草药均对猪源沙门氏菌有一定的抑制作用，苦参抑制作用最强，与抗生素效果一致，其次分别为黄芪、黄连、黄柏、甘草。□□

参考文献：（15篇，略）