外周血MAIT细胞数量在肝细胞癌患者诊断及预后中的应用研究

胡 晟

重庆市第四人民医院肝病科 (重庆， 400000)

肝细胞癌是全球高发的恶性肝脏肿瘤，其发病率逐年升高[1]。肝细胞癌患者往往预后差、总体生存率低[2]。寻找具有更高灵敏度和特异性的生物标志物对于促进肝细胞癌的早期诊断和预后评估具有十分重要的意义。黏膜相关恒定T细胞(MAIT)是新近发现的一种进化保守的T淋巴细胞，其表面标志物为CD3+CD161+Vα7.2+，主要分布于肠道黏膜固有层、肝脏和外周血中，在抵御细菌感染的过程中发挥重要作用，同时也参与多种炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生发展[3]。近年来，已有研究显示MAIT参与多种肝脏疾病的发生发展，但在肝细胞癌中的作用研究仍较少[4]。此外，已有研究发现外周血中MAIT的数量与结肠癌、胃癌、肺癌患者的临床特征具有一定的相关性，提示外周血中的MAIT可作为肿瘤的辅助诊断方法[5,6]。本研究探讨了肝细胞癌患者外周血MAIT数量在肝细胞癌诊断和预后判断中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究获得我院伦理委员会审批通过，所有受试人员均知晓本研究操作所具有的全部风险，并签署知情同意书。纳入标准：①年龄20～70岁；②符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中肝细胞癌诊断标准[7]；③确诊后尚未接受手术和放化疗治疗。排除标准：①患有其他恶性肿瘤；②合并有感染、心脑血管疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或其他全身系统性疾病；③依从性差或无法配合研究者。收集我院初诊确诊的肝细胞癌患者32例作为实验组，其中男18例，女14例；年龄25～68岁，平均(48.5±17.5)岁。此外，本研究纳入32例健康体检人员作为对照组，其中男17例，女15例；年龄21～65岁，平均(44.5±20.4)岁。对照组与实验组患者在年龄、性别方面比较，差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集与分离 在清晨空腹条件下，分别收集两组人员外周血10ml加入含EDTA的抗凝试管中，立即进行分离。取新的50 ml离心管，将10 ml外周血加入离心管中，随后用注射器缓慢加入等量10 ml Percoll分离液(1.073 g/ml)，保持外周血与Percoll分离液之间的液面不被打破，以2 000 rpm离心30 min。离心后可见两液相界面有白色膜状层。用巴氏吸管小心吸取中间白膜层，加入10 ml PBS缓冲液充分混匀，以2 000 rpm离心10 min，离心后可见细胞团块沉淀于离心管底部，此细胞团块则为包含MAIT的外周血单个核细胞。

1.2.2 MAIT细胞数量检测 将上述外周血单个核细胞进行计数，调整浓度为1×1010/L，吸取100 μl细胞悬液加入流式管中，分别加入10 μl PE Mouse Anti-Human CD3抗体(BD phaemingen公司)、10 μl APC Mouse Anti-Human CD161抗体(BD phaemingen公司)、10 μl FITC anti-human TCR Vα7.2 antibody(Biolegend公司)，充分混匀后于室温下避光孵育30 min。随后加入PBS缓冲液5 ml，混匀后以2 000 rpm离心5 min进行清洗。清洗后每管加入PBS缓冲液200 μl，通过FACSVerse 流式细胞仪进行检测，分析MAIT数量与比例。其中MAIT/T细胞比例定义为CD3+CD161+Vα7.2+MAIT占CD3+T细胞的百分比，MAIT绝对数量定义为1 μl外周血中含CD3+CD161+Vα7.2+MAIT数量。

1.2.3 随访方法 实验组患者采用门诊、电话随访等方式进行随访，随访以患者确诊当日为起点，截止时间为2018年11月30日，随访时间为10～48个月。本研究实验组患者均按期随访，无失访率。对照组患者采用电话随访方式，了解其生活及患病情况。对照组人员在随访中均未发生肝脏疾病或其他恶性肿瘤。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，采用Mann-WhitneyU检验比较外周血MAIT细胞数量。通过t检验比较实验组患者临床数据与外周血MAIT数量之间的相关性。通过ROC曲线下面积(AUG)明确外周血MAIT数量作为肝细胞癌诊断的诊断效能。通过Kaplan-Meier方法计算生存率和Log-rank检验进行组建生存曲线比较。检验水准α=0.05，P<0.05认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 两组人员外周血MAIT数量 对照组人员的MAIT比例为(3.14±0.19)%，而实验组患者MAIT比例为(1.23±0.09)%，明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。对外周血中MAIT数量进行分析，结果发现对照组人员外周血中MAIT数量为(65.22±2.74)个/μl，实验组患者明显降低，仅为(25.78±1.92)个/μl，两组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。

2.2 实验组患者外周血MAIT数量与临床参数的相关性分析

为了探讨外周血MAIT数量在肝细胞癌中的临床应用价值，从年龄、性别、肿瘤大小、结节数量、远处转移与否、甲胎蛋白(AFP)水平、Child-Pugh分期、TNM分期7个层面对实验组患者进行分组，对比不同亚组患者间外周血MAIT数量的差异。TNM分期为III～IV期患者中，其外周血MAIT细胞数量减少更为明显与Ⅰ～Ⅱ期者比较，差异具有统计学意义。结果证实在肝细胞癌患者，外周血MAIT细胞数量与其性别、年龄、肿瘤大小、结节数量、肝功能分期无关，而与其远处转移、AFP、TNM分期有关。见表2。

表2 实验组患者临床参数与其外周血MAIT数量的相关性

2.3 实验组患者外周血MAIT细胞数量作为诊断标志物的效能分析 对实验组患者外周血MAIT数量进行ROC曲线效能分析，结果提示ROC曲线下面积AUG为0.885，标准误为0.042，95%置信区间为0.803～0.968(P<0.001)。

2.4 实验组患者外周血MAIT数量与预后相关性分析 以肝细胞癌患者外周血MAIT均值作为分界值(25.78个/μl)，将实验组患者分为高MAIT水平组(>25.78个/μl，16例)和低MAIT水平组(<25.78个/μl，16例)，采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验计算两组患者生存曲线。通过分析，高MAIT水平组患者的中位生存时间为30.5个月，低MAIT水平组患者的中位生存时间为21个月，高MAIT水平组患者的生存时间明显高于低MAIT水平组，两组差异具有统计学意义(χ2=7.028，P=0.008)。

3 讨论

肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，据我国国家癌症中心2018年公布数据，肝癌以9.59%的发病率位居我国癌症发病率第4位。在青年男性中，肝癌的发病率更是超过肺癌跃居第一位，发病年龄逐渐低龄化，严重影响我国青壮年男性的健康[8]。由于肝细胞癌患者早期常常无特异性症状和体征，许多患者确诊时已经是中晚期，治疗效果差，预后不佳。如何提高肝细胞癌患者的早期诊断效率，评估患者预后，是临床需要解决的重要问题之一[1]。近年来，已有许多研究对肝细胞癌患者早期诊断和预后评估进行了深入研究，发现了包括miRNA、细胞因子等在内的多种疾病相关标志物。然而，这些疾病标志物在外周血中浓度较低、检测误差大，仍存在一定的局限性[9,10]。因此，寻找肝细胞癌高敏感性和特异性的诊断标志物，仍然是当前的重要研究目标。

MAIT由Porcelli等于1993年首次发现其存在于肠黏膜淋巴组织中，具有由一条Vα7.2-Jα33链和另一条限定的Vβ2或Vβ13链构成恒定的T细胞受体，是一群进化相对保守的T淋巴细胞[11]。不同于其他T细胞，MAIT细胞能够识别主要组织相容复合体相关分子1(MR1)，限制性呈递微生物来源的维生素B族代谢产物，从而发挥抗菌功能，是人类T细胞的重要亚群，广泛参与人体的各种生理和病理过程[12～14]。近年来，研究结果显示MAIT细胞除了存在肠道黏膜外，还广泛存在于肝脏和外周血中。在肝脏中，MAIT的数量占全身MAIT数量的20%～50%；而在外周血中，MAIT的数量更占外周血循环中T细胞数量的1%～10%[4]。外周血和肝脏中MAIT数量改变，导致MAIT在其中的分布比例不同，往往与肝脏疾病的发生、发展密切相关[15]。Ashare等发现，丙型肝炎病毒感染后患者外周血的MAIT数量明显减少，与丙型肝炎患者肝脏纤维化的程度明显相关[16,17]。但肝细胞癌患者外周血中的MAIT细胞数量是否发生变化，目前仍没有报道。发现肝细胞癌患者外周血中MAIT占T细胞的比例较对照组人员显著降低。且MAIT的绝对数量也明显减少，仅为对照组人员的1/3。这提示MAIT可能参与了肝癌的发病与进展。既往文献报道，MAIT细胞可以参与恶性肿瘤的发病过程，在肾癌、结肠癌等肿瘤组织中均发现有MAIT的浸润[5]。已有学者推测这些浸润的MAIT由外周血循环进入肿瘤组织，通过分泌一系列炎症因子，改变局部肿瘤微环境，调控肿瘤细胞的功能，外周血中MAIT数量减少可能正好反映了肿瘤进展的程度。由本研究结果，我们推测在肝细胞癌患者中，外周血MAIT也可能通过同样的机制进入肝脏并浸润在肿瘤组织周围，导致外周血MAIT的减少，同时它也参与了肝细胞癌的发病。

肝细胞癌患者年龄、性别、肿瘤大小、结节数量和肝功能情况并不影响外周血中MAIT的数量。这与既往的研究结果相似，在不同年龄、性别的人群中MAIT数量并无很大差异[18]。而在高AFP(>400 μg/L)、有远处转移、高TNM分期(III、IV期)的患者中，其MAIT数量更低。这提示，恶性程度更高的肝细胞癌患者，其外周血的MAIT降低更为明显，特别是对于有远处转移的患者，其平均MAIT细胞数量仅为(20.45±3.18)个细胞/μl，为所有亚组中最低，这可能是MAIT细胞在转移灶中也存在大量浸润，从而进一步减少了其外周血中的数量。

已有实验结果证实，外周血MAIT数量可作为脓毒症的早期诊断指标[19]。既然肝细胞癌患者的外周血MAIT数量对比正常人具有明显的差异，那么这个指标是否可以作为肝细胞癌的诊断标志物，并用于评估患者的预后？我们通过ROC曲线对MAIT数量的诊断效能进行分析，结果提示外周血MAIT数量在诊断肝细胞癌中具有较高的准确性，可作为肝细胞癌的诊断标志物之一。既往文献报道，当前诊断肝细胞癌最常用的指标AFP的AUG约为0.85～0.9[20]。我们的结果不仅发现外周血MAIT数量与AFP的高低具有较高的相关性，同时也提示其可与AFP进行组合，共同作为肝细胞癌的诊断指标，提高了临床诊断的敏感性和特异性。

MAIT数量在疾病、特别是恶性肿瘤患者的预后评估中，同样具有重要意义。本研究结果提示外周血中较低的MAIT数量预示患者预后更差。外周血MAIT数量不仅可作为肝细胞癌诊断的重要辅助手段，也是判断患者预后的重要依据。

然而，肝细胞癌患者肝脏和转移灶组织中MAIT浸润情况与数量、MAIT通过何种机制参与了肝癌的发生、发展等问题仍需要进一步研究。此外，本研究样本数较少，研究结果尚需在大样本的临床实验中进一步确认。