基于生物信息学分析和预测人骨肉瘤中Gab2靶向作用的miRNA分子

张 蕊，吴启洋，刘纪明，郭晓仪，吴龙火

(赣南医学院 1.药学院制药工程教研室；2.2017级制药工程专业本科；3.2016级制药工程专业本科，江西 赣州 341000)

骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，是儿童和青少年中第三大常见癌症，仅次于淋巴瘤和脑癌[1]。它是间充质来源的肿瘤，是一种恶性肿瘤，主要影响长骨但还可以累及身体其他骨骼。80%以上的骨肉瘤患者在诊断时有转移性或微转移性疾病，除手术外，几乎所有患者都要接受多药物化疗[2]。手术治疗的发展已经显著减少了切除肢体的风险，已成为主要的治疗方法。随着时间的推移，患者的预后也有所改善，由于治疗方法和化疗的进步，生存率从低于30%上升到超过70%[3]。尽管取得了这些进展，但针对骨肉瘤的新的靶向药物和生物标记物仍有很大的研究空间，需要不断完善[4]。

Grb2相关结合蛋白2(Grb2-associated binding protein2，Gab2)是体内一类支架蛋白，是生长因子受体结合蛋白2 ( Growth factor receptor-bound protein 2, Grb2)的相关结合蛋白家族(Grb2-associated binder protein, Gab)。在人类当中Gab家族有4个分子，它们的生物学功能十分复杂[5]。Gab2是这个家族中的重要的组成成员，它是酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)激活的下游信号通路中的关键分子[6]，参与了细胞内多种信号通路的转导，其含有pleckstrin同源(PH)结构域，并且可以结合SHP2酪氨酸磷酸酶和Grb2衔接蛋白，通过充当细胞因子和生长因子受体以及T细胞和B细胞抗原受体响应刺激的适配器而传递各种信号[7]。在许多肿瘤中，Gab2蛋白的表达水平明显增高，与肿瘤的发生发展密切相关[8]。在临床上，Gab2也可以作为许多肿瘤的分子标记物[9-11]。近年来研究证明Gab2蛋白与细胞的多种生物学进程相关，如肿瘤细胞生长和血管生成[12]、肿瘤细胞增殖[13]、侵袭和转移[14]，并且Gab2蛋白也参与了细胞的分化[15]等过程。在人骨肉瘤中Gab2也有着关键的作用，周学军等人研究发现，在29例骨肉瘤组织中Gab2的mRNA含量和蛋白含量均显著高于骨样骨瘤组织，骨肉瘤组织中TAp73、Beclin1、Caspase-1的mRNA含量和蛋白含量均显著低于骨样骨瘤组织且与Gab2的mRNA含量和蛋白含量呈负相关，STMN1、Survivin的mRNA含量和蛋白含量均显著高于骨样骨瘤组织且与Gab2的mRNA含量和蛋白含量呈正相关，说明骨肉瘤组织中高表达的Gab2能够抑制原癌基因的表达、增加促增殖和迁移基因的表达，进而促进骨肉瘤组织中细胞的生长、迁移[16]。平勇等也证明了Gab2在人骨肉瘤U2-OS细胞系中高表达，并且通过siRNA抑制Gab2后对人骨肉瘤U2-OS细胞的迁移和侵袭能力有明显的抑制作用[17]。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为18～24个碱基的单链小分子RNA，具有多种不同的生物学功能和病理学意义。它是由双链的pre-miRNA经过Dicer酶加工后生成，在转录后水平调控靶基因的表达[18]。近年来很多研究表明，miRNAs在肿瘤发生、增殖、转移及凋亡中起到了十分重要的调控作用[19-21]。与正常乳腺细胞相比，低转移的乳腺癌细胞中miR-125b表达明显更低，而在高转移的乳腺癌细胞中，其表达量增加。进一步研究证明miRNA-125b可以通过靶向作用于STARD13而诱导乳腺癌的转移[22]；在膀胱癌细胞中，miR-22表达下调，并且通过靶向结合MAPK1、Snail 抑制细胞的转移，促进细胞凋亡[23]。各研究表明miRNAs具有多靶点、组织特异性和高效性的调控特点。而在人骨肉瘤中，表达异常的miRNA也有很多，如与正常的骨组织相比，miR-543的表达明显上调，并且miR-534能够促进人骨肉瘤细胞的生长[24]；因此，以miRNAs作为切入点，有可能为治疗骨肉瘤提供一种新的、多层次、多途径的肿瘤治疗策略[18]。

每一个miRNA具有多个作用靶点，而每一个蛋白的mRNA又能结合多个miRNAs，miRNA-靶基因的作用机制复杂，调控网络十分庞大，在各种疾病的发生进程中起着十分重要的作用。目前关于Gab2在人骨肉瘤中的研究很少，虽然已经证明在人骨肉瘤中，Gab2表达上调，并且下调Gab2的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移，但是对于Gab2的调控机制并没有具体地阐述[25]。本研究通过生物信息学分析方法，预测和评价了人骨肉瘤中可能与Gab2结合的miRNA分子，为进一步研究人骨肉瘤中Gab2的调控作用机制提供理论基础，并为临床研究人骨肉瘤靶向治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料实验需要的硬件是一台电子计算机，需要的软件及在线程序见表1。

表1 预测与Gab2靶向结合的miRNAs所使用的在线程序及网站

1.2实验方法

1.2.1MiRWalk2.0预测与Gab2靶向结合的miRNAsMiRWalk 2.0是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠、大鼠以及狗等物种的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。MiRWalk 2.0整合了多种不同算法对预测数据的处理，以期得到靶蛋白-miRNAs可能的结合位点。MiRWalk 2.0有12个在线生物信息学软件，如targetScan、miRDB、miRTarBase、MicroT4等，也就是说，它可以通过对这12个软件的预测结果进行分析整合并取“交集”，从而得到能够与Gab2靶向结合的miRNAs。

1.2.2MiRanda软件对预测得到的与Gab2结合的miRNAs进行结合稳定性和特异性的分析MiRanda数据库提供了关于人类、果蝇和斑马鱼等物种基因组的miRNA靶目标的预测信息以及miRNAs在不同组织中的表达谱。将Gab2输入miRanda在线程序的“Target mRNA search”框中，可以得到Gab2和与之靶向结合的miRNA的mirSVR score和PhastCons score，用以判断Gab2和miRNAs结合的特异性和稳定性。

1.2.3miRNA表达谱数据的获得及差异miRNA分析从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中下载miRNA芯片数据GSE70367，GSE70367包括1个正常的人间充质干细胞株，5个人骨肉瘤细胞株。数据预处理后，使用GEO自带的GEO2R软件分析miRNA芯片数据。对骨肉瘤组和正常组的差异表达miRNA进行筛选，筛选阈值为P<0.05，log|FC|>1。

2 结 果

2.1MiRWalk2.0对Gab2靶向结合的miRNAs预测MiRWalk 2.0中，12个在线预测软件有8个软件预测到22个miRNAs可能与Gab2相结合，结果如表2所示。将获得的22个miRNA分子与Gab2的结合情况进行下一步的分析，预测和寻找结合特异性及稳定性较好的miRNAs。

表2 MiRWalk 2.0 在线软件预测与Gab2靶向结合的miRNAs

2.2Gab2与预测得到的miRNAs结合的稳定性和特异性评分利用miRanda软件对miRNA-Gab2进行热力学稳定性评分和序列保守性评分。MirSVR score是蛋白与miRNAs结合的热力学评分，该评分越低表明蛋白和miRNAs靶向结合的概率越大，在miRanda软件中这个评分是判断靶向关系的十分重要依据。结果如表3所示，通过结果发现：miR-1236-3p和miR-218-5p与Gab2结合的热力学稳定性评分分别位于第一位和第二位，说明它们的结合稳定性和特异性均较高。PhastCons score是序列保守性评分，表示的是基因非翻译区在不同物种中的进化保守性强弱，该评分越高则表明序列保守性越强，蛋白和miRNAs靶向结合的概率越大。与Gab2结合的热力学稳定性评分较高的miR-1236-3p和miR-218-5p，它们的序列保守性评分也比较高，分别位于第二位和第六位，说明在不同物种间的序列保守性相对较高，结果如表3所示。这两个结果表明，miR-1236-3p和miR-218-5p与Gab2 3'UTR靶向结合的可能性较高，具有很好的特异性，进一步说明，Gab2可能是miR-1236-3p和miR-218-5p的靶基因。

表3 Gab2-miRNA结合稳定性和特异性评分及miRNA不同物种间的序列保守性评分

2.3骨肉瘤中差异表达的miRNA筛选我们对下载的GSE70367原始数据进行处理后用GEO2R对差异表达的miRNA进行分析，其中骨肉瘤组vs对照组得到184个差异表达的miRNA,对于差异miRNA，其中124个miRNA上调，60个miRNA下调。在结果中选取表达下调和上调程度最大的前20个miRNA，结果见表4和表5，设定的阈值为P<0.05，log|FC|>1。在结果中，我们发现miRWalk和miRanda预测得到的靶miRNA中miR-218-5p在该芯片中也差异表达，并且表达下调。

表4 骨肉瘤细胞中表达下调的miRNA Top20

表5 骨肉瘤细胞中表达上调的miRNA Top20

3 讨 论

骨肉瘤是由骨质的产生来界定的，在所有儿童病发的癌症中骨肉瘤占3%～6%，占成人的1%[26]。它的发病机制并不是很清楚，诱发骨肉瘤的原因有包括放射或化疗史，有Paget的疾病史或其他良性骨病变和遗传病，包括遗传性视网膜母细胞瘤，Li-Fraumeni综合征，Rothmund-Thomson综合征和Bloom Werner综合症[27]。存活率较差是为什么骨肉瘤为目前癌症诱发死亡的第二大原因。而与骨肉瘤相关的miRNA的发现为更好的地了解和解决这种侵袭性骨癌提供了生物学的分子基础[28]。在骨肉瘤中miR-513a-5p下调表达，同时APE1的过表达。有趣的是，当APE1被敲除时，miR-513a-5p的水平更高;因此，在骨肉瘤中miR-513a-5p与APE1表达之间存在反比关系。 此外，恢复miR-513a-5p的水平可以使细胞对电离辐射敏感。这对APE1产生负面影响，并且该基因的表达降低可增强放射敏感性诱导后续凋亡[29]。而miR-21,miR-224及miR-138也证明参与了骨肉瘤的化疗[30-32]。由此可见，miRNA在骨肉瘤中发挥着重要的作用，寻找骨肉瘤中差异表达的miRNA对该疾病治疗有重要意义。

Gab2是一类缺乏酶活性的支架蛋白，虽然它没有酶活性，但是可以通过介导蛋白质-蛋白质的相互作用来调节信号转导中的许多效应分子，如生长因子受体、细胞因子受体以及整合素等，使这些受体与包含Src同源性结构域2(SH2)的效应器相结合[33]。当配体刺激受体后，活化的受体发生自身磷酸化并且提供磷酸化的酪氨酸位点用于招募Grb2[34]。Gab2能与Grb2结合，并且在多个酪氨酸位点被磷酸化，从而与SHP2、p85的SH2结构域结合。这种相互作用诱导构象发生变化，解除了SHP2催化位点的自动抑制，并且减少了p85对PI3K中P110催化亚基的抑制作用[35]。Xinran Li等报道，在卵巢癌中敲除PIK3R1后，卵巢癌细胞表现出一系列致瘤性的表型。PIK3R1的缺失将通过诱导磷酸化蛋白质Gab2激活AKT和p110非依赖性JAK2/STAT3信号通路，因此，Gab2可以降低AKT的抑制作用，同时能够促进JAK2/STAT3信号[36]。YU等人发现miR-486-5p在非小细胞肺癌中表达下调而Gab2上调，进一步实验证实miR-486-5p可以通过抑制Gab2而抑制细胞的增殖和侵袭[37]。虽然有实验证明在骨肉瘤中Gab2表达上调，并且与癌症的发生转移密切相关，但有关其机制研究几乎是空白。

miRNAs调节动物中大多数基因的表达，经典miRNAs的合成是通过RNA聚合酶Ⅱ转录产生初级miRNAs(pri-miRNAs)，然后这些pri-miRNAs被RNase Ⅲ Drosha切割形成前体miRNAs(pre-miRNAs)，前体miRNAs从核转移到细胞质，它们在那里进一步被RNase Ⅲ Dicer切割成22nt长的双链RNA[38]。其中一条链被选择并加载到Argonaute蛋白上，最终通过结合靶mRNA抑制基因的表达[38]。靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)结合靶向miRNA抑制其翻译和促进降解，mRNA与miRNA的结合是通过碱基互补配对完成的，有60%以上的编码蛋白的基因收到miRNAs的调控[39]。在骨肉瘤中差异表达的miRNA和其他疾病一样有很多，目前已经开发了许多计算技术来预测miRNAs的靶基因并引入多种特征以帮助识别其靶基因，比如miRNA上不同区域的互补性，结合位点保守性或靶位点的可及性。与此同时出现了许多在线软件利用各种算法来预测miRNAs与靶基因的结合，这些软件有Targetscan、Pictar2、PITA、mirbridge、miRMap等。但是不同的预测算法基于的是不同的miRNA-mRNA结合特征，单个预测软件预测准确性不高，因此，整合多样化算法可以改善目标预测。MiRWalk正是包括几种不同算法的预测结果，以涵盖所有这些因素，在预测miRNA靶基因相互作用方面会有更好的准确性，同时，miRWalk数据库提供有关基因miRNA相互作用的最新信息且免费更新[40]。MiRWalk结构清晰，界面直观，可方便用户快速、成功地捕获数据，执行统计分析，可视化和下载Gene-miRNA网络[41]。

本文正是利用MiRWalk预测到有22个miRNAs可与Gab2靶向结合，其中，miR-1236-3p、miR-218-5p与Gab2结合的稳定性和特异性最好，说明Gab2是miR-1236-3p、miR-218-5p备选靶基因；而利用miRanda软件对miRNA-Gab2进行热力学稳定性评分和序列保守性评分发现，miR-1236-3p、miR-218-5p序列保守性评分也较高，进一步佐证了MiRWalk的预测结果。基因芯片等高通量筛选技术的发展对各种肿瘤中的表达差异物质的检测大大降低了科研工作者的工作量，本研究中下载了GEO公共数据库储存的人骨肉瘤的miRNA芯片数据GSE70367。使用GEO2R的方法对获得的数据进行筛选，我们发现来自正常和骨肉瘤细胞株中差异表达的miRNA有184个，其中124个miRNA上调，60个miRNA下调。比对miRWalk和miRanda数据库得到靶miRNAs，发现miR-218-5p在骨肉瘤中差异表达，且表达下调。因此，miR-218-5p可能是Gab2的靶miRNAs。MiR-218-5p与肿瘤的发生发展密切相关，如miR-218-5p通过LYN/NF-κB信号通路抑制宫颈癌的生长和转移。MiR-218-5p靶向作用于LHFPL3，在预防胶质瘤细胞的侵袭性中起重要作用。MiR-218-5p在口腔鳞状细胞癌细胞中表达下调，并且通过抑制CD44-ROCK通路调控口腔鳞状细胞癌细胞的侵袭。

近年来虽然关于Gab2的研究如火如荼，也有Gab2与miRNAs的很多相关，但是其在人骨肉瘤中的研究特别少，虽然已经证明在人骨肉瘤中，Gab2表达上调，并且下调Gab2的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移，但是对于Gab2的调控机制以及Gab2-miRNAs的关系并没有具体地阐述[25]。由此可见，分析与Gab2结合的miRNAs，研究miRNAs在人骨肉瘤中是如何靶向调控Gab2具有重要的临床意义。很多研究已经证明Gab2是一个癌基因，通过miRNAs的沉默作用降低Gab2的表达有可能成为治疗人骨肉瘤及其他疾病的一种手段， miR-218-5p可以认为是抑癌因子，本研究发现miR-218-5p与Gab2靶向结合性很好，但是miRNA-靶基因之间的结合仅通过预测准确性并不是一定的，因此还需要通过后续的实验来验证预测得到的miR-218-5p是否能靶向调控Gab2。这也是本课题组后续将要进行研究的内容之一。