复方芩兰口服液儿童用药最佳有效剂量的研究

孙静，郭姗姗，韩冰，葛一蒙，赵荣华，时宇静，包蕾，毛鑫，崔晓兰*

(1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 158400)

儿童作为一个特殊的群体，身体器官和生理功能尚未发育成熟，因此在众多的药品不良反应和药害事件中，儿童往往会成为受害群体之一。究其原因，除了儿童的抵抗力较弱外，根本原因还在于药品缺乏儿童型及使用不规范所致。初步统计表明，我国约40%～60%的西药及中成药说明书没有明确的儿童使用剂量。“小儿减半、儿童酌减”之类的含糊字眼给临床治疗造成极大困扰，因此，明确成人用药改儿童用药的用法用量，为儿童临床应用提供参考，意义重大。

复方芩兰口服液为已上市中成药，功能主治为辛凉解表，清热解毒，临床用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛。现说明书用法用量为：成人每次10～20 mL，每日3次，儿童酌减或遵医嘱。本次研究目的是探讨复方芩兰口服液儿童用药的最佳有效剂量范围，为儿童临床应用提供参考。研究中，剂量设计采用已知成人用量换算儿童用量的计算方法(包括体质量换算、体表面积换算，比例换算，年龄换算法)设定1～12岁儿童的用药范围、采用与功能主治相关的主要药效学幼龄动物实验模型、对已设定剂量范围的有效性进行评价；最终初步确定儿童用量的最佳剂量范围。

1 实验材料

1.1 动物

ICR小鼠(SPF/VAF级)，体质量14.00±1.00 g，3周龄，雌雄各半，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，动物许可证SCXK(京)2012-0001。

1.2 病毒株

流感病毒FM1株，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，本实验室传代，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 受试药物

复方芩兰口服液，由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司提供。批号：B14160601，生产日期：2016.6.8，有效期：2018.6。用法用量：口服，60 kg成人用量每次10～20 mL，每日3次，小儿酌减或遵医嘱；性状：棕黄色至深棕色的澄清液体。储存条件：密封，置阴凉处(不超过20℃)。

1.4 阳性对照药

小儿感冒口服液(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号14262324)，利巴韦林颗粒(四川百利药业有限责任公司，批号150144)，阿司匹林肠溶片(Bayer Health Care Manufacturing S.r.l，批号BJ26800)，复方甘草片(华润双鹤药业有限公司，批号15012101)。

1.5 试剂

营养肉汤(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20140320)，冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，批号20141121)，乙醚(北京化工厂，批号20120131)，氨水(国药集团化学试剂有限公司，批号20120918)，脂多糖(SIGMA公司，批号046M4045V)。

1.6 仪器

A2型生物安全柜(Thermo，型号：MSC1.8)，低温高速离心机(Eppendorf，型号：5810R)，电子天平(上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002)，电子分析天平(OhausCorp.Brock. WJ.USA，型号：AR1140)，多功能酶标仪(PerkinElmer，型号Enspire)，电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，型号：BSA3202S-CW)，超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：402A)，IVC小鼠饲养笼(苏州教学笼具厂)。

2 方法

2.1 剂量设置

根据品种现在成人用量，采用4种换算方法[1]均得到1～12岁小儿用量在0.6～1.1 mL·(kg·d)-1之间，试验中扩展剂量范围，选择0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16个剂量进行实验。换算成小鼠用量分别为2.2、5.5、7.7、9.9、12.1、15.4 mL·(kg·d)-1；家兔用量分别为0.6、1.5、2.1、2.7、3.3、4.2 mL·(kg·d)-1。

2.2 抗病毒作用

2.2.1 对流感病毒(FM1株)感染幼龄小鼠致肺炎模型的治疗作用

取ICR小鼠100只，体质量(14.00±1.00)g，3周龄，雌雄各半，按体质量等级随机分为10组，分别为正常对照组、模型对照组、利巴韦林对照组、小儿感冒口服液对照组、复方芩兰口服液2.2、5.5、7.7、9.9、12.1、15.4 mL·(kg·d)-16个剂量组，每组10只。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL。感染当天各给药组灌胃给药，0.02 mL·g-1，每日1次，连续4 d，正常对照组和模型对照组在同等情况下给蒸馏水。于第5日称体质量后，小鼠脱颈椎处死，然后解剖取肺组织，称重，计算肺指数及肺指数抑制率。结果采用组间比较t检验进行统计学处理[2]。

2.2.2 对流感病毒(FM1株)感染幼龄小鼠致肺炎模型的死亡保护作用

取ICR小鼠180只，体质量(14.00±1.00)g，3周龄，雌雄各半，随机分为9组，每组20只。各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以2个LD50流感病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL。感染当天各给药组灌胃给药，0.02 mL·g-1，每日1次，连续4 d，模型对照组在同等情况下给蒸馏水。观察感染后2周内动物的死亡情况，计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果采用组间比较卡方检验和t检验进行统计学处理[3]。

死亡率=( 死亡数/动物总数 )×100%

2.3 抗炎作用:对冰醋酸致幼龄小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

取ICR小鼠100只，体质量(14.00±1.00)g，3周龄，雌雄各半，按体质量等级随机分为10组，每组10只。各给药组灌胃给药，0.02 mL·g-1，每日1次，连续3 d，正常对照组及模型对照组在同等情况下给蒸馏水。最后1次灌胃给药1 h后，每只小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液0.2 mL/只，并尾静脉注射0.5%伊文思兰溶液0.2 mL/只，20 min后脱颈处死小鼠，用生理盐水冲洗腹腔，每只5 mL并收集腹腔液，在1 000 r·min-1离心5 min，取上清液，用多功能酶标仪在590 nm处测定吸光度，以t检验进行统计学处理，比较模型对照组与给药组是否有统计学差异[4]。

2.4 止痛作用：对冰醋酸致幼龄小鼠疼痛模型的影响(扭体实验)

取ICR小鼠100只，体质量(14.00±1.00)g，3周龄，雌雄各半，随机分为9组，每组10只。各给药组灌胃给药，0.02 mL·g-1，每日1次，连续3 d，模型对照组在同等情况下给蒸馏水。于第3 d给药1 h后，小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液0.2 mL/只。注射冰醋酸5 min后立即观察小鼠扭体情况，记录15 min内扭体次数[5]。

2.5 止咳作用：对氨水致幼龄小鼠咳嗽模型的止咳作用

筛选合格小鼠：取ICR小鼠，体质量(14.00±1.00)g，3周龄，雌雄各半，以25% 氨水超声雾化喷雾引咳15 s，观察小鼠从喷雾开始到出现腹肌收缩张嘴的时间，1.5 min 内不出现咳嗽者弃去。

观察药物作用：将合格小鼠随机分为9组，每组10只。各给药组灌胃给药，0.02 mL·g-1，每日1次，连续3 d，模型对照组在同等情况下给蒸馏水。于第3 d给药1 h后，各小鼠以25% 氨水超声雾化喷雾引咳15 s，以小鼠腹肌收或缩胸，同时张大嘴为咳嗽指标，观察各组小鼠自喷雾开始至出现咳嗽的潜伏期及3 min内的咳嗽次数，结果进行统计学处理[4]。

2.6 统计方法

结果采用组间比较t检验进行统计学处理[6]。

3 结果

3.1 抗病毒作用

3.1.1 对流感病毒(FM1株)感染幼龄小鼠致肺炎模型的治疗作用

采用流感病毒FM1株感染幼龄小鼠后，小鼠肺指数均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)；复方芩兰口服液0.2、0.5、0.7、0.9 mL·(kg·d)-1剂量组均可抑制流感病毒FM1引起的肺指数增高，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)，抑制率分别为37.63、29.36、27.47、21.55%。见表1。

表1 复方芩兰口服液对流感病毒FM1株感染幼龄小鼠致肺炎模型的治疗作用

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.1.2 对流感病毒(FM1株)感染幼龄小鼠致肺炎模型的死亡保护作用

采用流感病毒FM1株感染幼龄小鼠后，小鼠死亡率为100%；复方芩兰口服液0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-15个剂量组可降低感染所致小鼠死亡率，与模型对照组比较有显著差异(P<0.05、P<0.01)；0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16个剂量组均可延长平均存活天数，与模型对照组比较有显著差异(P<0.05、P<0.01)。见表2。

组别死亡率/%保护率/%平均存活天数生命延长率/%模型对照组1007.60±0.82利巴韦林组2575.00**12.75±2.24**67.76小儿感冒口服液7525.009.95±2.65**30.92复方芩兰1.4 mL·(kg·d)-1剂量组5050.00**11.50±2.69**51.32复方芩兰1.1 mL·(kg·d)-1剂量组4555.00**11.45±3.02**50.66复方芩兰0.9 mL·(kg·d)-1剂量组6040.00**10.80±2.88**42.11复方芩兰0.7 mL·(kg·d)-1剂量组6040.00**10.85±2.78**42.76复方芩兰0.5 mL·(kg·d)-1剂量组6535.00*10.45±2.86**37.50复方芩兰0.2 mL·(kg·d)-1剂量组7525.0010.10±2.45*32.89

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 抗炎作用：对冰醋酸致幼龄小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

复方芩兰口服液所试0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-15个剂量组均可明显抑制冰醋酸引起小鼠腹腔毛细血管通透性增高，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)。见表3。

3.3 止痛作用：对冰醋酸致幼龄小鼠疼痛模型的影响(扭体试验)

复方芩兰口服液所试0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16个剂量组均可明显减少醋酸致小鼠疼痛的扭体次数，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01)。见表4。

3.4 止咳作用：对氨水致幼龄小鼠咳嗽模型的止咳作用

复方芩兰口服液0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-1剂量组可减少氨水引起的小鼠咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)。见表5。

表3 复方芩兰口服液对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

注：正常对照组比较,##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

表4 复方芩兰口服液对冰醋酸致小鼠疼痛模型的影响

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

表5 复方芩兰口服液对氨水致幼龄小鼠致咳嗽模型的止咳作用

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

流感病毒是一类重要的，在世界范围内具有高发病率和高死亡率的呼吸道病毒，也是小儿病毒性肺炎的主要病原体。幼儿由于受到解剖生理学特点、呼吸系统及免疫系统发育不成熟等因素影响，一旦感染流感病毒，临床上常出现发病急，持续高热，咳嗽喘息，甚至喘憋等症状，若不能及时治疗，严重者会导致死亡[7]。

目前防治流感的西药耐药性日益严重，而用于治疗小儿流行性感冒的有效中药复方制剂也相对缺乏[8]。复方芩兰口服液为已上市的成人用药，临床上常被用来治疗儿童流感，但说明书中对于儿童用量的表述为“小儿酌减或遵医嘱”，没有明确的儿童使用剂量。本研究根据成人用药换算儿童用药的换算方法，设定1～12岁儿童的用药范围、采用甲型流感病毒(H1N1亚型)FM1株感染幼龄小鼠造成病毒性肺炎模型及毛细血管通透性实验、扭体实验和氨水引咳实验研究复方芩兰口服液对幼龄小鼠的抗病毒、抗炎、镇痛、止咳作用，从而对已设定的剂量范围的有效性进行评价，初步探讨儿童用量的最佳剂量范围，为儿童临床用药提供有效性及用法用量的参考。

复方芩兰口服液主要成分为金银花、黄芩、连翘和板蓝根，具有辛凉解表，清热解毒的功效。方中金银花味甘性寒，具有清热解毒、疏散风热功效，连翘味苦性微寒，具有清热解毒、消肿散结的功效。黄芩味苦性寒，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。方中的特别之处是加入了板蓝根，其味苦性寒，具有清热解毒、凉血利咽的功效，善于清解实热火毒，与疏散风热药相伍，是治疗外感风热、温病初起的最佳配伍。临床应用表明其对急性上呼吸道感染具有很好的疗效[9-10]，现代药理学研究表明，金银花具有广谱抗菌、抗病毒及解毒抗炎作用，其主要活性成分为绿原酸[11]；连翘具有抗炎、抗菌作用，其主要活性成分为连翘苷[12]；黄芩具有抗炎、镇痛、抗菌、解热等作用，其主要活性成分为黄芩苷[13]。板蓝根对流感病毒、革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等均有抑制作用，还可发挥增强免疫力及明显的解热功效[14]。

本研究旨在探讨复方芩兰口服液儿童用药的剂量范围，故选用出生21～27 d(3周龄)，同时保证体质量在(14.00±1.00)g范围内的幼龄小鼠进行实验。抗病毒实验结果显示，复方芩兰口服液0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16个剂量组均可降低感染所致小鼠死亡率、延长平均存活天数，与模型对照组比较有显著差异(P<0.05、P<0.01)，其中0.2、0.5、0.7、0.9 mL·(kg·d)-14个剂量组肺指数明显降低，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)。提示实验设置的6个剂量范围合理，复方芩兰口服液在所选剂量范围内具有较好的抗病毒作用。

许多研究表明中药具有多靶点及整体调节的特点，不仅具有直接抗病毒的作用，而且具有消炎、镇痛、提高免疫力等功效，比单一抗病毒药物治疗更具优势[15]。本实验中扭体反应结果表明与模型组相比，复方芩兰口服液0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16个剂量组均可明显减少醋酸致小鼠疼痛的扭体次数，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01)，提示6个剂量组均具有较好的镇痛作用，0.9～1.4 mL·(kg·d)-13个剂量组镇痛效果较强。小鼠腹腔毛细血管通透性实验和氨水引咳实验结果表明，复方芩兰口服液0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-15个剂量组均可明显抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增高，减少氨水引起的小鼠咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)。

综上所述，复方芩兰口服液在0.5～1.4 mL·(kg·d)-1剂量范围内对幼龄小鼠模型均具有良好的抗病毒、抗炎、镇痛、止咳的作用，本实验结果为儿童临床用药提供了有效性及用法用量的参考。