甘肃东部地区羊接触传染性脓包皮炎PCR方法的检测和应用

张 莉，豆思远*，任章章

（1.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046；2.陇南市动物疫病预防控制中心，甘肃 陇南 742500）

羊接触传染性脓包皮炎是由传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）感染绵羊、山羊引起的一种急性、高度接触性的人畜共患病[1]。主要特征是唇、鼻、眼睑、乳房、四肢皮肤及口腔黏膜出现丘疹、水疱、脓疱和痂皮等[2]。该病多发生在一岁以内的羔羊，其中3～6月龄羔羊是最易感。ORFV抵抗力十分顽强，可持续多年对羊群造成危害[3]，已是影响我国乃至世界公共安全卫生的一个重要隐患。ORF在世界各地羊群频繁发生且常呈群发性流行[4]。

20世纪70年代国内外就开始ORFV分子生物学研究，自2004年Delhon揭开ORFV全基因组研究序幕[5]，2006年Mercer揭示ORFV基因组两末端区部分反向重复序列存在高度变异性[6]。随着研究深入，ORFV基因组结构、特性及其功能因子等逐步得到明确。本研究针对ORFV全基因序列中较保守的B2L设计引物，建立PCR诊断方法。为确定建立的PCR诊断技术检测羊接触传染性脓包皮炎病毒（ORFV）基因的准确性，本研究对甘肃省平凉市华亭县、庆阳市环县和镇原县、庆阳市和张掖市肃南裕固族自治县的临床样品进行检测，旨在确定该诊断技术在临床快速检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样品 血样采自甘肃省平凉市华亭县、庆阳市环县和镇原县、庆阳市和张掖市肃南裕固族自治县的养殖场和散养户。每只羊经颈静脉无菌法采取新鲜血液8 ml，按1:5抗凝剂与血液体积比加入ACD（100 ml抗凝剂中含柠檬酸0.48 g，柠檬酸三钠1.32 g，葡萄糖1.47 g）抗凝。所有血液样品分装并保存于-70℃。

1.1.2 主要试剂 PCR试剂（Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP），DNA Marker、琼脂糖等均购自宝生物工程(大连)有限公司；ddH2O（双蒸水，Distillation-Distillation H2O），70%乙醇，异丙醇溶液（-20℃预冷），6mol/LNaI溶液，氯仿-异戊醇（24:1）溶液，醋酸钠溶液（3mol/L）等均为为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器与设备 TGL-18B-C离心机（上海安亭科学仪器厂），TC-700 PCR仪（Funglyn Biotech Inc生产，上海枫岭生物技术有限公司供货），凝胶成像系统-TC-240（上海天呈科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 羊基因组DNA提取 严格按照NaI法提取静脉抗凝血ORF病毒DNA[7]，提取羊基因组DNA后经8g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并将基因组冷冻保存。

1.2.2 引物设计与合成 参照GenBank收录的羊序列（B2L）设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成[8]。

引物序列如下：

上游引物：5′-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3′

下游引物：5′-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3′

反应体系如下（表1）：

表1 ORFV基因的扩增体系

1.2.3 PCR扩增

离心混匀后置PCR扩增仪中进行扩增，PCR扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶检测。扩增程序如下（表2）：8.0 ml PCR扩增产物与2.0 ml上样缓冲液离心混匀后，经15g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取

经8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，其完整性良好，证明从羊全血中获得基因组DNA。

2.2 ORFV基因的扩增

PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，ORFV基因的扩增产物在540 bp的位置出现特异条带，条带清晰，表明成功获得目的DNA片段。

2.3 PCR检测ORFV的结果

表3统计结果中，四个县的羊接触传染性脓包皮炎阳性检出率分别为23.74%、14.56%、41.06%、9.78%。

环县羊接触传染性脓疱皮炎检测阳性率逐年降低，由34.78%降至15.02%。

3 讨论

从表3的统计结果可见，四个县的的羊接触传染性脓包皮炎阳性检出率从9.78%～41.06%，差别很大，从一定程度了反映了该病在不同地区流行和发病的高低。镇原县和华亭县较低，反映了这两个县近些年肉羊养殖规模化程度高，羊只流通监管力度强有关；肃南县血液采集自传统牧区皇城镇，羊只饲养量大，流通频繁，23.74%的阳性检出率也和近年羊接触传染性脓包皮炎发病情况一致；环县近几年大力开展肉用羊只和绒山羊养殖，同时在进行滩羊改良，新建羊场、羊群较多，引种、流通频繁，这些因素都能加速该病扩散，使当地阳性检出率高。

表2 ORFV基因的扩增程序

表3 2013年ORFV检测阳性率

这四个县的羊只饲养量大、分布广，血样采集的随机性很大，加之血样采集时间的不同，都可能使测定数据有偏差，这需要增加血样采集区域、提高采集频率，来提高实验数据精准性。

从表4可见，随着近年来防控和治疗方法的普及，环县羊接触传染性脓疱皮炎检测阳性率逐年降低，一方面是养殖户在日常管理、圈舍消毒、病羊隔离、粪便无毒处理和科学化引种、配种方面防病意识加强，另一方面是结合PCR诊断检测结果，对羊接触传染性脓疱皮炎阳性率高的羊场重点开展治理，如建立档案进行羊只追踪、限制活羊流通等手段，从源头上控制了该病传播、扩散。

表4 2014-2016年ORFV检测阳性率