冷吃兔特定腐败菌的分离与鉴定

彭先杰 黄婷婷 于跃 袁玉梅 肖夏 郑连强 袁先铃

摘 要：对冷吃兔的腐败细菌进行分离、生理生化鉴定及分子生物学鉴定。通过稀释平板划线法分离腐败微生物，获得纯菌落。将分离的纯菌株接种到无菌冷吃兔中富集培养，测定菌落总数和挥发性盐基氮含量，确定特定腐败菌;通过生理生化实验结果，以《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》为参考进行菌种初步鉴定;通过DNA提取、聚合酶链式反应扩增和凝胶电泳将菌株准确鉴定到种。结果表明：引起冷吃兔腐败变质的特定腐败菌为沃氏葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

关键词：冷吃兔;特定腐败菌;生理生化鉴定;分子生物学鉴定

Abstract： Bacteria from spoiled cold spicy rabbit meat were isolated and identified by physiological， biochemical and molecular biological methods. The pure strains， obtained by the streak plate method， were re-inoculated onto sterile spicy rabbit meat and enriched. The aerobic bacterial count and total volatile basic nitrogen （TVB-N） content were measured to identify the specific spoilage organisms （SSO）. These strains were tentatively identified according to the Bergeys Manual of Determinative Bacteriology and the Manual for Systematic Identification of Common Bacteria and further identified to the species level by sequential DNA extraction， polymerase chain reaction amplification and gel electrophoresis. The SSO in cold spicy rabbit meat were Staphylococcus warneri and Bacillus subtilis.

Keywords： cold spicy rabbit meat; specific spoilage organisms; physiological and biochemical identification; molecular biological identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057

中图分类号：TS251.6                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）05-0019-05

引文格式：

彭先杰， 黄婷婷， 于跃， 等. 冷吃兔特定腐败菌的分离与鉴定[J]. 肉类研究， 2019， 33（5）： 19-23. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057.    http：//www.rlyj.net.cn

PENG Xianjie， HUANG Tingting， YU Yue， et al. Isolation and identification of specific spoilage organisms in cold spicy rabbit meat[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 19-23. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057.    http：//www.rlyj.net.cn

兔肉具有高蛋白、高赖氨酸、高卵磷脂、高消化率、低脂肪、低胆固醇、低脲酸及低热量的“四高四低”特性，富含维生素、硫胺素、核黄素、不饱和脂肪酸、各种矿物质、少量的碳水化合物和脂肪等，易消化，其中多种氨基酸为人体必需氨基酸，色氨酸和赖氨酸含量均高于其他肉制品，因此具有保健、益智、美容、强身及养胃功能[1-3]。“十三五”以来，我国兔产业发展呈持续增长态势[4]。

冷吃兔又名香辣兔，能在常温下食用，无需加热，故称之为“冷吃”[5]。冷吃兔食客多、消费量大，未来消费市场潜力巨大，是市场发掘兔肉资源、有效利用、增值的重要途径[6-7]。冷吃兔属于油浸类产品，脂肪、水分含量偏高，极易受微生物污染，引起产品腐败[8-9]。目前，每年约有25%的肉类产品在微生物作用下失去其营养价值[10]，引起肉类腐败的优势菌群称为特定腐败菌（specific spoilage organisms，SSO）[11]，SSO對环境忍耐力强，生长繁殖迅速，具有很强的致腐能力，存在于真空包装低温肉制品中的SSO主要为乳酸菌[12-14]，其次是肠杆菌[15]、热杀索丝菌[16]。为了延长产品保质期，减少浪费，研究冷吃兔中特定腐败微生物影响生产加工的作用机理迫在眉睫。

本研究通过腐败变质冷吃兔的微生物分离，获得其单菌落，筛选得到引起冷吃兔腐败变质的SSO，并对其进行生理生化实验，初步将其鉴定到属，结合分子生物学鉴定，确定SSO的种类，为抑制冷吃兔优势腐败菌生长、延长产品货架期等工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

兔肉、香辛料均购于自贡市沃尔玛超市。

冷吃兔制备：兔肉切丁、腌制、炒制、冷却、装袋、抽真空，制备过程严格遵守无菌操作规程，用75%酒精消毒、火焰灼烧制备工具清除杂菌。无菌袋样品密封保存于25 ℃无菌环境，待用。

1.2 仪器与设备

DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（配备先进的数控加工设备） 上海齐欣科学仪器有限公司;YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌锅（配备国家专利安全连锁装置/手轮式快开门设备） 上海博讯实业有限公司;Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪（配备专用计算机软件管理及进样器系统） 福斯分析仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株腐败特性实验

微生物的分离：将腐败的冷吃兔做成稀释梯度为10-1～10-7的菌悬液，将后5 个稀释度的菌液接种到牛肉膏蛋白胨琼脂平板，37 ℃培养24 h;挑选每个梯度培养基中的典型菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线分离，直至得到纯菌落，将分离后的菌种编号为A～J。

SSO的选定：将A～J菌株分别加入灭菌后的冷吃兔中，37 ℃培养24、48、72 h;通过测定菌落总数和总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，确定菌株的致腐能力，将致腐能力较强的几株菌作为SSO。

菌落总数测定：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物學检验 菌落总数测定》[17]。TVB-N含量测定：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[18]。

1.3.2 SSO的生理生化鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》[19]，对SSO分别进行革兰氏染色、生长温度与耐热性实验、需盐性和耐盐性实验、需氧性实验、接触酶实验、淀粉水解实验、明胶水解实验、碳源利用实验、V-P测定实验、柠檬酸盐实验和硝酸盐实验。

1.3.3 SSO的分子生物学鉴定

用接种环沾取分离到的细菌菌株，在聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系中扩增。16S rDNA基因扩增引物上游序列：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物序列：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。PCR扩增条件为：94 ℃、5 min，98 ℃、10 s，53 ℃、15 s，72 ℃、20 s;98、53、72 ℃共35 个循环;72 ℃、5 min，4 ℃保持。PCR反应体系为：25 μL 2×Taq-PCR MIX、2 μL 16S rDNA-F、2 μL 16S rDNA-R、2 μL Genomic DNA、19 μL ddH2O。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收，送成都肇科生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.4 数据处理

根据测序鉴定结果，在NCBI数据库中进行BLAST软件比对分析，找到相似菌属（种）后，使用MAGE 5软件绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 腐败菌株的分离筛选

2.1.1 腐败菌株的分离

反复平板划线得到10 株菌株，将其命名为A～J，菌株的菌落形态具体描述如表1所示。

2.1.2 菌落总数测定

菌落总数是判定食品受细菌污染的程度和检测卫生质量的标准[20]（国标中菌落总数需≤105 CFU/g[21]）。由表2可知，培养24 h时，菌株B、D、E、F的菌落总数明显高于其他菌株，培养48 h时，除菌株G、I外，其他菌株的菌落总数均超标。

2.1.3 TVB-N含量测定

挥发性盐基氮是动物性食品在酶和细菌的作用下，分解蛋白质产生氨及胺类等碱性含氮物质[22]（国标中TVB-N含量需≤35 mg/100 g[23]）。由表3可知，培养48 h时，菌株D、F的TVB-N含量均超标，远远高于其他菌株，说明菌株D、F是引起兔肉腐败变质的腐败菌，亦为目标菌株。菌株D、F的TVB-N含量在24、48 h快速增加，72 h增加减缓，且菌株D的致腐能力略大于F。菌株D、F对冷吃兔的致腐能力强于其他菌株，是贮藏过程中在菌落总数和TVB-N含量2 个指标下的目标菌株。因此，菌株D、F是冷吃兔贮藏过程中引起其腐败变质的SSO。

2.2 SSO的生理生化鉴定结果

革兰氏染色：革兰氏染色是鉴别细菌的一种方法，根据细菌细胞壁上主要成分的差异，将染色后的细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌（紫色）与革兰氏阴性菌（红色）[24]。菌株D的革兰氏染色结果呈紫色，革兰氏阳性菌，为球状;菌株F呈紫色，革兰氏阳性菌，为直杆状。生长温度与耐热性：菌株D、F分别在菌体细胞有最大波长（450 nm）处测定，37 ℃时生长量较佳。需盐性和耐盐性：菌株D在菌体细胞有最大波长（450 nm）处测定，盐浓度为2%时生长量较佳;菌株F在菌体细胞有最大波长（450 nm）处测定，盐浓度在5%时生长量较佳。需氧性实验：菌株D生长在半固体培养基的表面和底部深层无氧的地方，即菌株D的呼吸类型为好氧兼性厌氧型;菌株F仅在半固体培养基表面生长，即菌株F只能进行有氧呼吸，为好氧性细菌。

接触酶实验：菌株D、F与3%的过氧化氢反应产生气泡，菌株D、F均含有过氧化氢酶，能分解过氧化氢。淀粉水解实验：菌株D不能分解淀粉，菌株F能分解淀粉。明胶水解实验：菌株D不能分解明胶，不产生明胶酶;菌株F能产生明胶酶，分解明胶，破坏明胶状态。菌株F在明胶培养基上生长，再将培养基放在20 ℃以下，明胶不会凝固，呈液体状态。碳源利用实验：菌株D、F在利用糖类时均不产气，但能利用某些特定糖类，在生长过程中产酸。V-P实验：菌株D使溶液呈深红色，菌株F使溶液呈红色，故菌株D、F均为阳性。菌株D、F在利用葡萄糖时，将葡萄糖分解成2 分子丙酮酸，丙酮酸在一系列反应下形成乙酰甲基甲醇。柠檬酸盐实验：菌株D为阴性，菌株F为阳性。柠檬酸盐实验用来检验微生物是否能利用柠檬酸盐并将其作为唯一碳源，结果表明：菌株D不含有柠檬酸盐渗透酶，不能利用柠檬酸盐;菌株F含有柠檬酸盐渗透酶，能利用柠檬酸钠作为唯一碳源。硝酸盐还原实验：菌株D、F均能使溶液变红，故均含有硝酸盐还原酶，能把硝酸盐还原成亚硝酸盐、氨和氮。

分析得知：菌株D为革兰氏阳性菌，好氧兼性厌氧型球菌，判定为革兰氏阳性好氧球菌属，无芽孢，不运动，接触酶阳性，进一步判定为葡萄球菌属;不产生淀粉酶、明胶酶，能利用葡萄糖、蔗糖和β-D-果糖产酸，不产生吲哚，不利用柠檬酸盐，能产生脲酶分解尿素，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，与《伯杰氏细菌鉴定手册》[25]和《常见细菌系统鉴定手册》对比，初步确定为金黄色葡萄球菌的金黄色亚种或沃氏葡萄球菌。

菌株F為革兰氏阳性菌，好氧型，呈杆状，有芽孢，产酸，初步判定为革兰氏阳性好氧芽孢杆菌;接触酶阳性，有运动性，水解淀粉、明胶，发酵葡萄糖、乳糖和D-甘露醇产酸，V-P阳性，不产生吲哚，利用柠檬酸盐，不分解尿素，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。与《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对比，初步确定为枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。

2.3 SSO的分子学鉴定结果

菌株D、F的2%琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

由图2可知，菌株D为沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），菌株F为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3 结 论

菌株D是革兰氏阳性球形细菌[25]，显微镜下排列成葡萄串状，不生芽孢，兼性厌氧，菌落为乳白色或微黄色，不透明，无鞭毛，不运动。经验证，菌株D为沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），是葡萄球菌属的一种，在普通培养基上能大量生长，在营养丰富的肉制品中极易繁殖，从而引起肉制品腐败。沃氏葡萄球菌毒性较小，致病过程缓慢;耐热性强，巴氏杀菌条件下不易杀死，是一种能造成一些免疫力低下人群感染的侵袭性条件致病菌[26]，主要存在于人与动物的皮肤及黏膜上，与人类的动脉栓塞和牙周炎也有一定的关系[27]。

菌株F为嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，革兰氏染色阳性，可产生孢子，菌落粗糙、不透明、扩张、污白色或微带黄色。经验证，菌株F为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的一种，现作为芽孢杆菌属的模式菌种[28]，其生理特征多样，能产生多种抗菌素和酶，能液化明胶、胨化牛乳、还原硝酸盐、提高畜禽生产性能、改善肠道内微生态环境、调节肠道发育、增强机体免疫力，且具有极强的抗逆能力[29-30]。枯草芽孢杆菌在自然界中分布广泛，极易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境[31]。

冷吃兔中的SSO为沃氏葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，其中沃氏葡萄球菌对冷吃兔的致腐能力强于枯草芽孢杆菌。沃氏葡萄球菌存在于动物皮肤表面，冷吃兔中的沃氏葡萄球菌可能来源于肉兔或包装过程中人体的接触。枯草芽孢杆菌是常见食品腐败菌，在肉制品中生长快速，会引起冷吃兔的快速腐败变质，使营养物质大量损失。在冷吃兔的工业化生产中，可以从工艺条件、贮藏条件、包装条件等环节遏制优势腐败菌的生长，进而延长产品保质期，提高产品商业价值。

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收稿日期：2019-03-14

基金项目：四川省教育厅科技基金项目（15ZA0228）

第一作者简介：彭先杰（1995—）（ORCID： 0000-0002-1283-9482），女，硕士研究生，研究方向为食品安全工程。E-mail： 1284665667@qq.com

*通信作者简介：袁先铃（1979—）（ORCID： 0000-0002-3990-386X），女，副教授，硕士，研究方向为食品安全工程。E-mail： 82745373@qq.com