基于微流控芯片荧光检测的LED光源自适应补偿方法

樊夏辉，刘桂礼，孔全存,2，李 勇，王志强，钟 昊，徐 涛

(1.北京信息科技大学仪器科学与光电工程学院，北京 100192；2．清华大学机械工程系，精密/超精密制造装备及 控制北京市重点实验室，北京 100084；3.清华大学天津高端装备研究院，天津 300300)

0 引言

基于即时检验(point-of-care testing，POCT)的微流控技术具有样品消耗少、检测速度快及体积小等优点[1]。免疫荧光检测是微流控技术应用的主要手段之一[2]，而微流控芯片是实现便携式免疫荧光检测、即时检验的重要平台之一，其主要检测方式为利用光电探测器扫描测量微流控芯片流道上的荧光，以检测区与质检区扫描信号的面积之比表示检测结果[3]。为实现小型化和低成本，诱导荧光的光源采用LED(light emitting diode)[4]，但在扫描过程中LED光源的不稳定性，易导致检测区和质检区荧光信号采集的同步实时性变差，在很大程度上影响了检测精度和稳定性，故光源补偿对微流控芯片的免疫荧光检测至关重要。

现有的LED光源补偿方法主要有时间法、光强调制法、参数模型法和实时监测法等。时间法是通过一定的启动时间(数十min)补偿光源，使其达到平衡稳定[5]，但启动时间较长，且对工作环境的要求较高。光强调制法是根据光强波动调整其驱动信号，提高了光源的稳定性，且无需较长的启动时间[6-7]，但驱动信号的调整时间间隔(数min)较长，检测的同步实时性受限。参数模型法是建立光源的光强与驱动电流、工作温度等参数之间的非线性数学模型，以补偿光源，提高了其在复杂环境下的稳定性[8-10]，但不同光源之间存在差异性，难以用一个统一的模型表达。实时监测法是设置并监测参考光，根据参考光与检测结果之间的线性关系，将检测结果归一化，以避免光源的漂移特性和不同光源之间的差异性对检测结果的影响，提高其准确性和稳定性[11-13]，但对应点信号采集的时间延迟会引入误差和环境噪声干扰显著。

综上所述，现有补偿方法难以同时满足免疫荧光检测的同步实时性好、抗干扰性好及鲁棒性高等要求。因此，本文通过分析LED光源的漂移特性，引入光源时变补偿因子，提出并实现一种基于光源漂移特性的自适应补偿方法，并搭建高精度免疫荧光检测实验装置，开展对比实验，进行误差分析，验证其应用可行性。

1 基于光源漂移特性的自适应补偿方法

1.1 光路结构和微流控芯片

免疫荧光检测的光路结构分为非共聚焦和共聚焦，共聚焦相比于非共聚焦具有分辨率高、噪声小等优点[14]，本文以共聚焦式免疫荧光检测为研究对象。

如图1所示，LED发射出来的光，经聚光透镜减小发散角和滤光片滤除杂散光，再由二向色镜分为激发光和监测光，监测光被聚焦至监测光探测器，激发光经过下部聚焦透镜聚焦，对微流控芯片的流道进行扫描并产生荧光，荧光由下部聚焦透镜捕获后变成平行光，通过二向色镜和滤光片，滤除荧光以外的杂散光，被上部聚焦透镜聚焦至荧光探测器。其中，微流控芯片主要由加样腔、流体调节器、流道、检测区、质检区和废液仓等部件组成，扫描过程为“流道-检测区-流道-质检区-流道”，被测物位于检测区，而质检区为参考物以保证微流控芯片的有效性[15]。记光源强度为P(mW)，监测光强度为Q(mW)，激发光强度为I(mW)，荧光强度为F(mW)，二向色镜的反射率为m。

图1 共聚焦式免疫荧光检测光路结构和微流控芯片

在共聚焦光路中，激发光和监测光分别为光源经过二向色镜的反射光和透射光，则光源、激发光、监测光满足式(1)和式(2)：

P=I+Q

(1)

I=mP

(2)

根据理论分析，LED光源随时间以自然常数e为底的负指数形式衰减，则以式(3)拟合光源的漂移特性。

P=ke-λt+b

(3)

式中：k、λ、b为拟合系数。

1.2 免疫荧光检测中存在的问题

在微流控芯片免疫荧光检测中，通常以检测区和质检区的扫描信号面积之比表示检测结果。记检测区扫描信号的起始和结束时间分别为t1、t2，质检区扫描信号的起始和结束时间分别为t3、t4，检测结果为S，则

(4)

然而，光源不稳定导致检测区和质检区荧光信号采集的同步实时性较差和检测的一致性较差，如图2所示，在扫描过程中，LED光源随时间逐渐衰减，使得检测区和质检区的荧光信号在不同时间和不同的光强激发下被采集，即同步实时性难以保证；第ni次和nj次(i，j=1,2,3，……；i≠j)检测的光源漂移特性拟合系数k、λ和b是不同的，即当工作环境和光源不同(不同工作环境之间和不同光源之间存在差异性)时，光源的漂移特性呈现出差异性，对检测的一致性影响较大。

1.3 光源时变补偿因子及自适应补偿

微流控芯片上的被测物或参考物一般为稀溶液(真菌或病毒感染时，其浓度一般较低)，由朗伯-比尔定律可知[16]，荧光与激发光满足式(5)。

F=2.3φIεlC

(5)

式中：φ为荧光染料的荧光量子产率，%；ε为荧光染料的摩尔吸光系数，L/(mol·cm)；l为微流控芯片流道的厚度，cm；C为微流控芯片上被测物或参考物中荧光物质的浓度，mol/L。

根据式(4)和式(5)可知，微流控芯片的检测结果S为

(6)

式中：CT为检测区被测物中荧光物质的浓度，mol/L；CC为质检区参考物中荧光物质的浓度，mol/L。

将式(1)、式(2)和式(3)带入式(6)，可得：

(7)

(8)

通过式(8)使得微流控芯片的检测结果与时间、光源强度无关，实现对光源的自适应补偿。其中，光源时变补偿因子α以光源的漂移特性为依据，消除在扫描过程中光源衰减对检测结果的影响，保证检测区和质检区荧光信号采集的同步实时性；光源时变补偿因子α与拟合系数k、λ、b密切相关，当工作环境和光源改变致使k、λ、b发生变化时，α也随之改变，即光源时变补偿因子α具有自适应性，能够顺应光源和工作环境的改变，以抵消拟合系数k、λ、b的变化，避免光源漂移特性的差异性对检测结果的影响，有效提高免疫荧光检测的一致性、抗干扰性和鲁棒性。

2 实验与讨论

2.1 实验装置

为实现微流控芯片高一致性、高稳定性检测，本文搭建了高精度共聚焦式免疫荧光检测实验装置，主要由荧光探测器、监测光探测器、共聚焦光路、电动位移台及运动控制与数据采集单元等组成，如图3所示。

(a)运动控制与数据 采集单元 (b)共聚焦检测模块图3 共聚焦式免疫荧光检测实验装置

荧光探测器和监测光探测器为光电二极管模块，其分辨率为0.01 nW，灵敏度为300 mV/nW。标记被测物和参考物的荧光染料为CY5，其具有高分辨率、高灵敏度及低成本等优点。根据CY5的激发峰值波长为648 nm和发射峰值波长为666 nm，共聚焦光路中的光源选用功率为3 W和峰值波长为630 nm的LED，滤光片组由(625±30)nm的激发滤光片、(670±10)nm的发射滤光片和中心波长为650 nm的二向色镜等组成。电动位移台的分辨率为0.5 μm，其定位精度为2 μm。

2.2 LED光源漂移特性实验

在不同的LED光源和工作环境下，保持光源与监测光探测器相对位置不变，启动光源，每相隔1 min记录监测光探测器的输出，每次监测35 min，并拟合监测数据，共进行50组实验。

图4为典型的6组LED光源监测数据及其拟合曲线，表1为典型的12组LED光源漂移特性的拟合系数。由图4和表1可知，当光源启动后，其漂移特性与以自然常数e为底的负指数函数相符合，最大拟合偏差为0.007 V，拟合相关性达到99.3%以上；当工作环境和光源不同时，拟合系数k、λ、b不同，光源的漂移特性具有差异性，光源时变补偿因子α能够顺应其漂移特性的变化，对光源进行自适应补偿。

图4 LED光源监测及其拟合曲线

表1 LED光源漂移特性的拟合系数

2.3 微流控芯片免疫荧光检测实验

常用于免疫荧光检测的标志物有降钙素原、心型脂肪酸结合蛋白、D-二聚体及C反应蛋白等，检测范围分别为0.1～50、1～120、0.1～10、0.5～200 μg/mL[17]。其中，降钙素原是诊断和监测严重细菌性炎症和真菌感染的重要参数之一，其参考值为0.5 ng/mL，检测分辨率要求较高，若能够对降钙素原准确、稳定地实现检测，则其他亦可被轻易检出，故本文以降钙素原为例进行免疫荧光检测实验，具有实验代表性。

在不同的LED光源和工作环境下，利用实验装置分别检测降钙素原浓度为0.25、0.33、0.46、0.91、1.67 ng/mL的微流控芯片，每个芯片检测25次，记录补偿前和补偿后的检测结果。

图5为补偿前后免疫荧光检测实验对比，表2为补偿前后免疫荧光检测误差对比。其中，最大偏差为检测结果与标称浓度的最大差值， CV值(离散系数，coefficient of variation)为每个芯片所有检测结果的标准差与平均值之比，反映了检测的精密度。由图5和表2可知，补偿前检测的最大偏差为0.06 ng/mL，CV值小于0.53%，补偿后检测的最大偏差为0.01 ng/mL，CV值小于0.25%，则免疫荧光检测经过光源自适应补偿后，其一致性、抗干扰性和鲁棒性得到有效提高，检测分辨率达到0.01 ng/mL，CV值提高约50%。

图5 补偿前后免疫荧光检测实验对比

表2 补偿前后免疫荧光检测误差对比

3 结束语

为提高免疫荧光检测的一致性、抗干扰性和鲁棒性，实现微流控芯片高精度、高稳定性检测，本文提出并实现了一种基于LED光源漂移特性的自适应补偿方法，通过对比实验及误差分析，验证了其应用可行性，得到如下结论：

(1)进行LED光源漂移特性实验，建立光源自适应补偿模型，验证了光源的漂移特性符合以自然常数e为底的负指数函数，拟合相关性达到99.3%以上，并分析了光源时变补偿因子具有自适应性。

(2)提出并实现了基于微流控芯片荧光检测的LED光源自适应补偿方法，并进行对比实验及误差分析。结果表明，经过光源自适应补偿后，免疫荧光检测的分辨率达到0.01 ng/mL，CV值提高约50%。