MLN4924对索拉非尼耐药肝细胞癌细胞中neddylation修饰的抑制作用

孙 杰，刘 淦，李因茵，陆荫英

肝癌是世界发病率第六位高的癌症，肝癌患者病死率在所有癌症中位居第二，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是发病数最高的肝癌亚型，约占80%～90%。目前HCC的治疗主要依赖于外科手术，局部区域和系统性治疗方法[1-2]。在HCC早期阶段，主要运用外科手术对肝脏进行切除和移植；在中期阶段，主要采用消融疗法以及肝动脉化疗栓塞术等局部区域治疗，这些方法既能够与外科手术相互结合，也能够用于不适合手术的病例；在HCC的晚期阶段，对于不可进行肝切除或具有转移性HCC的患者，索拉非尼是惟一的一线系统性靶向药物。索拉非尼是口服的多靶点、多激酶抑制剂，于2007年被美国FDA批准用于HCC的治疗[3]。尽管HCC具有很多治疗手段，但患者的预后水平整体较差，仅有10%的HCC患者生存期超过5年。肿瘤复发是患者肝切除后5年内面临的一个巨大问题，而索拉非尼仅能延长约3个月的生命，对晚期HCC的治疗作用十分有限[4-5]。因此，综合与深入的研究HCC的发生、发展机制，开发新型有效的治疗手段，对于HCC患者的治疗和预后具有重要意义。

类泛素化修饰neddylation是一种蛋白质的翻译后修饰，能够调控细胞周期、细胞代谢和细胞内信号转导。蛋白质的neddylation修饰异常与肿瘤的发生、发展密切相关[6-7]。neddylation是由泛素激活酶E1，泛素偶联酶E2和泛素连接酶E3所介导的三步酶联反应组成。首先，神经前体细胞表达的发育性下调蛋白8（neuronal precursor cellexpressed developmentally down-regulated protein 8, NEDD8）通过其C端的甘氨酸与泛素激活酶NAE的半胱氨酸活性位点形成一个高能硫酯键。其中，泛素激活酶NAE是由泛素样修饰酶激活酶 3（ubiquitin like modifier activating enzyme 3,UBA3）与淀粉样前体蛋白结合蛋白1（amyloid precursor protein-binding protein 1, APPBP1） 组 成的异源二聚体。随后，经过转硫醇活化反应，活化的NEDD8被转移至泛素结合酶UBC12（ubiquitinconjugating enzyme E2M）上。最后，泛素连接酶E3将NED88转移到底物蛋白上完成对特异蛋白的neddylation 修饰[8]。

MLN4924是近年来发现的一种neddylation小分子蛋白抑制剂，能够抑制癌细胞的增殖和迁移，在临床前研究中具有显著的抗癌功效，目前已经进入了部分实体肿瘤和恶性血液病的Ⅰ期临床试验[9-13]。MLN4924能够通过与泛素激活酶NAE的结合产生共价化合物，从而抑制其活性，导致底物积累，进而引发DNA损伤反应，细胞周期停滞，细胞凋亡，以及细胞的自噬和衰老，抑制肿瘤细胞的生长[10，14]。但neddylation在HCC发生、发展中的作用，以及MLN4924在治疗HCC中的功效目前并不完全清楚。因此，本课题组对MLN4924在具有索拉非尼耐药性HCC细胞中的抗癌效果和机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2和Huh-7细胞系购自美国ATCC细胞库。抗NEDD8，APPBP1和Actin抗体购自Abcam公司。抗UBA3抗体购自GeneTex。抗UBC12抗体购自于Cell signaling。CCK试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。索拉非尼和MLN4924抑制剂购自Selleckchem公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养 HepG2和Huh-7细胞培养条件为含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的DMEM培养基，细胞培养在37 ℃，5 %CO2培养箱中。

1.2.2 CCK检测细胞增殖 取对数生长期 HepG2或Huh-7 细胞，以每孔 2000个细胞接种于 96孔板，每孔加150 μl培养基，细胞接种24 h后，按照实验设计的浓度梯度（0/0.25/0.50/1.00 μM）加入抑制剂MLN4924，培养后每孔加入 CCK-8 溶液 10 μl，继续培养 1～2 h；在酶标仪上测量各孔吸光度值，测定波长450 nm，记录结果并绘制细胞增殖曲线。

1.2.3 蛋白印迹实验 将HepG2和Huh-7细胞裂解后进行蛋白 SDS-PAGE，将胶浸泡于电转液中（Tris 25 mM，甘氨酸 190 mM，20% 甲醇），电泳结束后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，加入10%牛奶封闭1 h，加入封闭液稀释（抗体稀释倍数为1∶1000）的一抗后4 ℃过夜。用TBST（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1% 吐温 20） 洗涤 3 次，加入封闭液稀释的二抗，37 ℃孵育1 h，洗涤3次，最后用ECL显色。

1.2.4 索拉非尼耐药细胞的建立 在HepG2 和Huh-7细胞培养基中添加终浓度为0.25 μM的索拉非尼，初期每周更换1次培养基，中后期根据细胞汇合浓度提高换液频率。在建立初期，以48 h作为细胞传代周期；筛选4周后，培养皿中仅存活少量耐药细胞，将存活的耐药细胞消化并转移至规格适宜的培养皿中，以避免细胞密度过低影响生长状态；继续保持索拉非尼药物压力进行持续培养，并在细胞汇合度到达70%～80%时进行传代。经过6～7个月的培养，获得具有在终浓度为0.25 μM的索拉非尼压力下生存、传代能力的耐药细胞，我们在文中称之为HepG2-Sora和Huh-7-Sora[15]。

2 结 果

2.1 耐药HCC细胞的NEDD8修饰通路高度活化 用索拉非尼刺激HepG2和Huh-7 HCC细胞，检测野生型细胞与索拉非尼耐药细胞中NEDD8的表达量变化。结果显示，与野生型HepG2和Huh-7细胞相比，索拉非尼耐药的HepG2-Sora和Huh-7-Sora细胞中NEDD8的蛋白表达量明显升高（图1A）。同时我们检测了与neddylation修饰相关的多个蛋白的表达变化。结果显示APPBP1、UBA3 和UBC12的表达在耐药细胞株中都有明显上调（图1B）。以上结果提示，与野生型细胞相比，索拉非尼耐药HCC细胞中NEDD8修饰通路活化。

2.2 MLN4924抑制细胞增殖的剂量依赖性 为了检测neddylation通路活化对索拉非尼耐药细胞增殖的影响。我们用不同浓度的索拉非尼（0～4 μM）处理HepG2和Huh-7野生型与耐药型细胞株，然后再用不同浓度的NEDD8活化激酶抑制剂MLN4924处理细胞。通过检测细胞增殖情况，我们发现在索拉非尼处理细胞之后，再加入不同浓度的MLN4924 能够进一步抑制细胞的增殖，并且抑制作用随着MLN4924抑制剂浓度的增加而增强（图2）。提示MLN4924能够抑制索拉非尼耐药细胞的增殖。

2.3 MLN4924抑制细胞增殖的时间依赖性 分别检测用2 μM索拉非尼处理后的耐药细胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora，再经MLN4924处理24 h、48 h、72 h和96 h后细胞的增殖情况。结果显示，Huh-7-Sora受MLN4924处理后细胞增殖明显减弱，且随着时间增加抑制效果增强（图3）。HepG2-Sora在MLN4924处理后24 h，细胞增殖就明显减弱，随着时间的延长抑制作用变化不明显（图3）。

图1 耐药HCC细胞的NEDD8修饰上调Short Exp.索拉非尼短期刺激（8 h）；Long Exp.索拉非尼长期刺激（48 h）；HepG2-WT.野生型HepG2；HohT-WT.野生型HohT-7Figure 1 NEDD8 modification is upregulated in sorafinib-resistant HCC cells

图2 MLN4924抑制索拉非尼耐药细胞的增殖Figure 2 MLN4924 inhibits the proliferation of sorafinib-resistant cells

图3 MLN4924抑制细胞增殖的时间依赖性Figure 3 Time-dependent manner of MLN4924 inhibiting cell proliferation

2.4 MLN4924抑制耐药HCC细胞的neddylation修饰 考虑到MLN4924对索拉非尼耐药细胞增殖的抑制作用，我们接下来检测了经MLN4924处理后索拉非尼耐药细胞中neddylation修饰的变化情况。通过蛋白印迹实验，发现MLN4924处理后的索拉非尼耐药细胞中NEDD8的表达量显著减少，并且随着MLN4924浓度的增强NEDD8表达减弱的更加明显（图4）。综上，MLN4924能够抑制索拉非尼引起的neddylation通路的活化，进而抑制HCC细胞的增殖。

图4 MLN4924抑制索拉菲尼耐药HCC细胞的neddylation修饰Short Exp.索拉非尼短期刺激（8 h）；Long Exp.索拉非尼长期刺激（48 h）Figure 4 MLN4924 inhibits neddylation modification in sorafinib-resistant HCC cells

3 讨 论

全球每年HCC新发病例数约80万人，死亡人数约78万，我国HCC统计数据约占全球统计数据的55%[16]。索拉非尼作为惟一的一线靶向治疗药物，主要通过两种方式发挥作用：一方面能够抑制血管内皮生长因子受体和血小板源性生长因子受体，阻碍肿瘤新生血管的生成，减少肿瘤生长所依赖的氧气、能量的供给；另一方面，能够阻断肿瘤细胞中重要信号通路的转导，抑制肿瘤细胞增殖[17]。然而，索拉非尼对晚期HCC的治疗作用十分有限，其在HCC中的反应率还有待提高[18]。主要原因在于HCC具有高度异质性，HCC的发生、发展与多个信号通路的激活相关，对癌细胞内单一信号通路的调控不足以达到良好的治疗效果；因此，开发新型有效的治疗手段刻不容缓。

细胞内neddylation的失调可导致癌症的发生，MLN4924作为一种neddylation小分子蛋白抑制剂，其在癌症治疗中的作用受到广泛关注。有研究报道，MLN4924能够抑制HepG2和Huh-7细胞系中mTOR信号通路的活性，诱导HCC细胞的自噬和凋亡[19]；并且在人HCC异种移植小鼠模型中，MLN4924表现出了显著的抗癌效果[19]。我们的研究发现，索拉非尼耐药HCC细胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora的NEDD8修饰通路高度活化，MLN4924能够通过抑制耐药细胞株的neddylation，从而抑制其细胞增殖。MLN4924对索拉非尼耐药细胞株HepG2-Sora的生长抑制效果具有剂量和时间依赖性；而对Huh-7-Sora的抑制效果仅具有剂量依赖性，没有显著的时间依赖性。MLN4924的单独用药，以及与索拉非尼的联合用药均为HCC治疗提供新思路。

其他种类癌症的相关研究表明，MLN4924能够阻碍胃癌与肾癌细胞的生长和迁移，这主要是通过抑制细胞中Clluin1的neddylation，使Cullin-RING连接酶失活，引发下游多种底物的积累，造成DNA损伤以及细胞周期阻滞[20-21]；MLN4924也能够抑制人食管鳞状细胞癌，MLN4924处理导致G2细胞周期阻滞，并增强Wee1样蛋白激酶，周期素依赖性激酶抑制剂1A/B和p27的蛋白稳定性[22]；在针对复发性淋巴瘤和多发性骨髓瘤的Ⅰ期临床试验中，MLN4924表现出了预期的药效和安全性[23]。

综上，MLN4924通过抑制细胞内neddylation的修饰，减少了索拉非尼耐受HCC细胞系的生长增殖。我们的研究为HCC细胞的耐药性及MLN4924的作用机制提供了理论依据，为未来HCC治疗手段和策略的开发提供了新的思路。