便携式核酸微全分析仪的设计与研发*

马俊杰 朱 信 李晓宁 任宇航 吴 丹 赵 爽 胡 笛 徐建栋*

近年来，现场核酸分子检测是现场快速检测(point-of-care testing，POCT)的热点领域，其发展迅速[1]。目前，面对各种新发和突发性传染病时，最经济有效的防控措施就是建立快速及准确的核酸分子诊断方法[2]。常规核酸分子检测手段需要复杂的样本处理和扩增技术，由于气溶胶的问题，需要严格的实验室分区及管理制度[3-5]。因此，需要大量的生化检测设备和环境要求严格的使用场地，若稍有操作不慎，就会造成污染和假阳性结果。核酸实验室污染后极难清除污染物，有可能造成实验室无法使用的风险[6-7]。因此，对实验室操作人员及日常维护管理提出了很高的要求。由于常规分子检测只能在实验室开展，故现场快速检测是业内亟待建立并使用的新技术，研发出小型化、便携化、微量化以及能够在现场进行快速检测的仪器设备势在必行。为此，本研究自主研制一款便携式核酸微全分析仪及配套微流控芯片，以满足进出口检验检疫、偏远地区快速疾病筛查等特殊环境下的快速现场分子诊断需要。

1 便携式核酸微全分析仪设计思路

在博晖创新GenPlex®微流控全自动核酸检测系统的基础上，将仪器的体积进行几何量级的压缩[8]。将关键模块中多层气动回路驱动模块、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)温控模块以及反向杂交温控部件等小型化后安装进小型安全箱中，以方便携带。增加微型化荧光检测模块，实现仪器荧光信号检测功能。充分保留GenPlex®微流控芯片“芯片上的分子实验室”的性能特点，并对微流控芯片进行结构改造，增加荧光检测窗口，在一个芯片上显现斑点杂交和实时定量PCR两种检测功能。适配多种核酸分子检测试剂，实现多种目标病原物检测。便携式核酸微全分析仪系统见图1。

图1 便携式核酸微全分析仪系统框架

2 便携式核酸微全分析仪主机结构

便携式核酸微全分析仪主机为通用型医疗装备，外观采用手提式箱体设计，便于携带和运输；内部由多层气动回路驱动模块、小型气源、芯片接口模块(集成PCR温控模块，反向杂交温控部件)、荧光检测模块、电器控制系统及PC显示模块等核心部分组成。该系统具有体积小、质量轻、携带便利以及使用方便等优点，能够在检测现场完成样品处理(细胞裂解)、核酸提取、基因扩增、扩增子检测(实时荧光定量，分子分型)等全部检测过程，真正做到微全分析，可满足快速现场核酸分子检测的需要。采用该仪器实现人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、Y染色体缺失(Y-chromosomal microdeletions，YMD)、禽流感及新城疫病毒等疾病检测。

2.1 主机系统外壳设计

便携式核酸微全分析仪外形尺寸为490 mm×360 mm×208 mm，整机重量13.4 kg；手提箱为工业级安全箱，由箱体和箱盖两部分组成，箱盖内部安装有工业级触屏液晶显示屏，箱体内为主机核心部件。在箱体上方固定有控制面板，面板部分主要包括电源开关电源指示灯、通用串行总线(universal serial bus，USB)接口和微流控芯片操作区。电源开关实现仪器主机系统内部电路与外接电源的快捷通断；指示灯可快速了解主机系统的电路通断情况，保障操作的安全性；USB接口可以外接鼠标键盘，用于操作软件，也可以通过触屏液晶显示屏进行操作。在箱体的侧方留有风扇散热口，可以保证系统适宜的工作温度。在箱体后方留有外接电源接口，输入电压12 Vdc，可适配车载电源，最大功率80 W(图2)。

图2 便携式核酸微全分析仪外观实物图

2.2 主机系统内部构造

分析仪主机系统内部由PC机、多层气动回路驱动模块、小型气源、芯片接口模块(集成了PCR温控模块，反向杂交温控部件)、荧光检测模块、电器控制系统及PC显示模块等核心部分组成(图3)。

图3 便携式核酸微全分析仪内部构造

(1)多层气动回路驱动模块和正负压小型气源。多层气动回路驱动模块和正负压小型气源构成了芯片驱动系统，通过芯片接口模块驱动微流控芯片上的微泵、阀协同工作，完成整个核酸分子检测的生化反应过程。多层气动回路驱动模块采用多层PMMA气路集成技术，集成了压力传感器、储气罐、气动阀及控制电路，使得复杂气路的控制高度集成，从而实现小型化。正负压气泵采用托马斯的1410系列，12 V供电，该系列气泵体积小，最大正压1.0 Bar，最大正压流速4.3 L/min，最大负压75%，最大负压流速3.7 L/min。

(2)芯片接口模块。芯片接口模块同样采用多层PMMA气路集成技术，将微型化PCR温控模块、反向杂交温控部件及微流控芯片泵阀气动接口等实现高度集成。微型化PCR温控模块和反向杂交温控部件具有小型化、低能耗、成本低廉以及热循环速度快的特点。该模块在实验室的工作环境下，最高可以达到5～6 ℃/s的热循环速度。与小型电扇制冷共用，相比半导体制冷热循环器能耗极大降低。图4为实测的PCR加热器升降温曲线:温度由室温升至30 ℃，待到平稳后，由30 ℃升至55 ℃，中间部分温度维持在55 ℃，最后降至30 ℃。温度维持在55 ℃区间时，温差≤±0.3 ℃。

图4 加热器升降温曲线

(3)荧光检测模块。荧光检测模块由4个通路组成，每个通路的光路由激发光源、准直透镜、激发滤光片、二向色镜、物镜、发射接收滤光片、接收聚焦镜、光电二极管及控制电路组成。每个通道可对应检测某一种或数种特定波段的荧光染料(图5)。

图5 四通道荧光检测模块光路

信号采集方式采用横向扫描，每个芯片会采集≥1000个采样点，然后根据采样点获得的荧光强度数据绘制成曲线，读出各PCR管式反应器对应的荧光信号。检测前，荧光探头由行程75 mm气缸牵动而沉于操作平台的下方，既能保证不与机箱上盖发生干涉问题，也能兼顾美观。检测时，荧光探头浮出于平台上方，并由直线滑台牵引对芯片下方的PCR管进行扫描，滑台导轨长度150 mm，滑台由步进电机和同步带牵引(图6)。

图6 四通道荧光检测方式

(4)控制系统。控制系统设计上位机部分主要是基于Java语言的控制软件和PC工控机组成，下位机主要由运动部件、荧光探头部件、气路控制组件以及温控组件组成。通过串口和CAN通讯实现上下位机的通讯控制，实现相关部件的运动配合(图7)。

图7 控制系统框图

3 便携式核酸微全分析仪芯片设计

微流控芯片为低成本聚苯乙烯芯片，通过芯片上的微通道、泵、阀、反应储液池以及一个DNA微阵列芯片，形成了PCR实验室的样品准备区、扩增区和扩增反应分析区，可自动完成细胞裂解、DNA的分离和纯化及检测。检测可以采用基于DNA微阵列芯片的反向杂交技术或者实时荧光定量(RT-PCR)技术(图8)。

图8 微流控芯片设计

微流控芯片一次性使用，一次处理4个样品；仅用1台该仪器即可在90 min内实现从样本前处理、核酸提取及PCR扩增到RT-PCR或者反向斑点杂交检测的全过程，构成可针对具体检测目标灵活配置的现场快速检测技术。实现HPV、YMD、禽流感以及新城疫病毒等疾病检测。

4 便携式核酸微全分析仪应用效果

便携式核酸微全分析仪可以对唾液、血液、尿等体液样本进行分析。使用该仪器，实现HPV、YMD、禽流感、新城疫病毒等疾病检测，其中HPV和YMD检测采用反向杂交法，禽流感和新城疫病毒采用实时定量PCR法。

4.1 HPV病毒检测

针对HPV基因组L1区设计特异性引物和探针，采用PCR体外扩增和DNA反向杂交法相结合的生物芯片技术，用于体外定性检测女性宫颈样本中HPV的DNA并进行基因分型，见表1。

4例临床样本(宫颈脱落细胞)检测结果，见表2。

表1 DNA阵列芯片点样对照表

表2 HPV检测结果

4.2 YMD检测

以Y染色体AZF区的6个STS位点(AZFa:sY84、sY86；AZFb:sY127、sY134；AZFc:sY254、sY255)为靶序列，见表3。

表3 DNA阵列芯片点样对照表

设计特异性PCR扩增引物及反向杂交捕获探针，采用多重PCR-反向斑点杂交法快速定性检测人Y染色体3个AZF区的6个STS位点是否存在缺失，从而辅助诊断男性不孕不育患者的病因分析。

4例临床样本(EDTA抗凝外周血)检测结果，见表4。

4.3 禽流感检测及新城疫病毒检测

实验样本为禽流感尿囊液、新城疫尿囊液样本及阴性对照。将待测样本加入到芯片加样孔后，在芯片上微泵的驱动下，首先进行病毒核酸的提取，然后针对目标靶点进行荧光PCR或者荧光RT-PCR的扩增，在扩增的同时进行荧光采集。实验结果为敏感性及特异性考察，其中特异性要求与新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒及鸭肝炎病毒无交叉反应(图9、图10)。

表4 YMD检测结果

图9 禽流感检测结果

图10 新城疫病毒检测结果

5 讨论

近年来，严重急性呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感及口蹄疫等事件接连不断的爆发，给公共安全带来了很大的风险，不仅对社会经济造成了巨大损失，也对人类的生活环境乃至健康安全构成了越来越严重的威胁，突发性外来传染病已成为全球关注的焦点[9]。外来动物入境前临床检疫，已成为抗击外来传染病入侵的重要关口，早发现、早治疗，将病情控制在初期是重要的防御手段，快速、便捷且高通量的新型便携式现场核酸分子检测方法在口岸检测中具备巨大的应用前景[10-11]。开展地方病监测，常规手段需要大量的生化检测设备和环境要求严格的使用场地，而少数民族等偏远地区受医疗卫生条件的限制，开展相关工作存在很大困难，致使这些地区发病率和病死率高。开发灵活、快速及低成本的小型分子诊断设备，可为偏远地区疾病检测提供很好的技术支持[12]。

现有的常规核酸的检测方法要经过样品前处理、核酸提取及PCR扩增等过程来完成，需要约2 d时间做出诊断，而现有的检测设备，只能在条件很好的实验室环境中工作，无法实施现场快速检测[13]。因此，亟待研发出能够在现场进行快速检测的仪器设备，为动物检疫和地方病检测等相关工作提供技术支撑。

本研究的便携式核酸微全分析仪具有自动、封闭、快速及灵敏等技术特点，可以在非分子实验室环境完成HPV、YMD、禽流感及新城疫病毒等检测项目，应用场所将从如今的中心实验室普及至检测现场，不需高水平的实验室条件、复杂的实验步骤和有经验的操作者，将极大地降低成本，提高检测效率，有望在病原体筛查、感染监测、检验检疫、食品卫生检验等诸多领域发挥积极作用。

6 结语

便携式核酸微全分析仪以快速和现场检测为特点，是微全分析系统的一项重大应用，是微流控仪器设备开发应用中的重要组成部分，可以满足现场疾病筛查和动物检疫的需求，是微流控芯片应用与产业化的技术飞跃。随着精准医学的发展，分子检测技术将迎来新一轮产业革命，未来将有越来越多的小型化、自动化的分子诊断相关技术和产品涌现，为提高人民的健康水平服务[14-15]。