特异性免疫治疗对桦树花粉过敏小鼠Th17细胞的影响

谢枝隽，尹 佳，周俊雄

哮喘是一种慢性气道炎症，由一系列呼吸道症状定义，如喘息、呼吸短促、胸闷和咳嗽，以及可逆的呼气气流限制，严重影响患者的生活质量[1]。近年来，随着哮喘发病率的上升，造成了严重的经济负担[2]。花粉诱导的过敏性哮喘是哮喘常见的表现形式，桦树花粉(Betula platyphylla)是我国北方地区春季主要致敏花粉。在欧洲，70%的桦树花粉过敏患者，伴有食物过敏症状，表现为进食桦树花粉相关的食物(苹果，芹菜和榛子)时出现不同程度的口唇肿胀[3]。特异性免疫治疗是唯一能有效控制桦树花粉诱导的过敏性哮喘症状，减少吸入激素的用量，改变过敏性哮喘自然进程的方法。桦树花粉特异性免疫治疗能抑制交叉反应所导致的食物过敏，减少食物诱导的严重过敏反应发生[4]。特异性免疫治疗主要通过皮下注射过敏原，诱导机体产生耐受，从而缓解症状。过敏症状的缓解与Th2型免疫抑制有关，包括降低Th2相关细胞因子水平，如IL-4、IL-5、IL-13等[5-6]。此外，过敏症状的缓解还与IgG4相关，IgG4被认为是保护性抗体，与特异性IgE竞争，抑制肥大细胞脱颗粒。Th17细胞是机体免疫重要的调节细胞，在过敏性哮喘的发生、发展中有重要作用[7-8]。Th17细胞主要受转录因子Rorc调控，通过分泌IL-17A在哮喘中发挥作用[9-10]。推测特异性免疫治疗缓解过敏性症状，也会对Th17细胞有影响。本研究通过建立中国桦树花粉诱导的小鼠哮喘模型，观察特异性免疫治疗对Th17细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c小鼠，体重18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，在北京协和医院动物房饲养，饲养环境符合SPF级实验动物标准。实验过程中，给予实验动物人道关怀，并通过北京协和医院伦理委员会审批。

1.2 桦树花粉

桦树花粉提取物由北京协和医院变应原制剂室提供，花粉蛋白浓度检测使用BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass)。

1.3 动物模型构建

BALB/c小鼠于第1、8、15天，颈后皮下注射100 μl的0.25 μg/μl桦树花粉溶液和100 μl氢氧化铝佐剂(Imject Alum，Thermo，USA)，共计200 μl。第24～26天，采用雾化激发的方式，雾化吸入0.1%的桦树花粉溶液，连续3 d，每天30 min。第27天，行肺功能检测，24 h后取材(图1)。

对照组使用phosphate buffered saline(PBS)代替桦树花粉，其余操作如前(图1)。

特异性免疫治疗组：桦树花粉致敏激发小鼠，从第32天开始，颈后皮下注射150 μl桦树花粉溶液 (2 μg/μl)，隔天一次，总计8次。第53～55天，雾化吸入0.1%的桦树花粉溶液，连续3 d，每天30 min。第56天行肺功能检查，24 h后取材(图1)。

1.4 气道高反应性测定

使用DSI公司的无创肺功能仪器NAM(Non-Invasive Airway Mechanics)进行小鼠肺功能检测。主要评价指标是比气道阻力(sRaw)值，为气道阻力与胸腔气量的乘积。将小鼠放入校正好的密闭肺功能测定腔内，让其适应环境5 min，分别雾化给予PBS，给予1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/ml的乙酰甲胆碱(Sigma，German)。每次给乙酰甲胆碱后，纪录sRaw值。

1.5 血清细胞因子检测

采用割尾法收集小鼠血于1.5 ml EP管中，4 ℃过夜；第2天，4 000 r/min，4 ℃离心10 min，吸取清亮上清于新的EP管中，-80 ℃冻存备用。使用高通量多因子检测平台Luminex 200TM，多因子试剂盒Milliplex Catalog ID.MCYTOMAG-70K-06.

Mouse Cytokine MAGNETIC Kit (Millipore, Billerica, USA)检测血清细胞因子IL-4和IL-17A水平。具体操作严格遵照说明书。

1.6 血清桦树花粉特异性免疫球蛋白测定

血清桦树花粉特异性免疫球蛋白(sIgE，sIgG1，sIgG2a)采用酶联免疫吸附法测定。碳酸盐缓冲液(pH9.6)作为包被液，稀释桦树花粉，包被96孔板(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)，100 μl/孔，4 ℃过夜。次日，使用PBST清洗96孔板3次，每孔加入200 μl封闭液(1% BSA-PBST)，室温封闭2 h。小鼠血清用封闭液稀释，分别1∶200稀释用于IgG1检测，1∶200稀释用于IgG2a检测，1∶10稀释用于IgE检测。稀释后血清加入对应96孔板中，100 μl/孔，4 ℃过夜。PBST清洗后，二抗用封闭液按照1∶1 000稀释，100 μl/孔，室温孵育2 h。加入TMB显影剂后，用酶标仪在450 nm处读数，记录。实验重复3次。二抗分别是：Rat Anti-Mouse IgE (HRP) (ab99574, Abcam, Cambridge, UK), Goat Anti-Mouse IgG1 heavy chain (HRP) (ab97240, Abcam, Cambridge, UK)和Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) (ab97245, Abcam, Cambridge, UK)。

图 1 动物模型构建

Fig 1 Animal model

1.7 脾脏Th17细胞检测

试剂PerCP/Cy5.5 anti-mouse IL-17A购自Biolegend公司(BioLegend, San Diego, USA)；Anti-Mouse CD4 FITC 50 μg购自eBioscience公司(eBioscience, San Diego, USA)。将小鼠脾脏放入300目细胞过滤网袋，置于含10%胎牛血清(Hyclone, Logan, Utah)的RPMI 1640培养基中。在培养皿上，用注射器橡胶头轻轻研磨组织，使细胞渗出过滤网，进入培养基。收集单细胞悬液，离心弃上清。加入红细胞裂解液后室温放置10 min，离心弃上清。PBS洗涤后，用含刺激剂(PMA，Ionomycin和Golgistop)的培养基重悬细胞，在37 ℃，5% CO2的细胞箱内培养5 h。离心后加入CD4-FITC，室温避光孵育30 min。洗涤后加入固定打孔液，室温避光孵育30 min。使用打孔洗涤液洗涤细胞后，加入IL-17A抗体，室温避光孵育30 min。使用流式细胞仪FACS Canto plus (BD Biosciences, San Jose, USA)检测，检测结果以淋巴细胞%CD4+IL-17A+表示，FlowJo软件进行后续分析。

1.8 Transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)检测

采用TRIzol法提取脾总RNA，Trizol试剂购自天根生化科技(北京)有限公司，型号DP405-02。采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa，RR047B，日本)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (TliRNase H Plus)和ROX plus(Takara Bio, Inc., Otsu, Japan)用于cDNA扩增。qPCR仪器为ABI 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)。目的基因引物序列在北京Invitrogen公司合成，上下游序列见表1。PCR扩增反应：95 ℃，30 s；40个PCR循环(95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，从60 ℃缓慢加热到99 ℃。结果用2-△△Ct进行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.9 肺组织病理

肺组织石蜡包埋后，将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4 μm。行H&E染色和AB-PAS染色。H&E染色：石蜡切片脱蜡，苏木素染细胞核，伊红染细胞质；脱水封片，显微镜镜检。染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色，用于评估气道周围炎症细胞的浸润。AB-PAS染色：石蜡切片脱蜡，阿利新蓝染色，高碘酸染液染色；切片入雪弗染液30 min，避光；脱水封片，显微镜镜检。酸性黏液物质染色呈蓝色，糖原和中性黏液物质染色呈紫红色。AB-PAS染色用于评估气道黏液产生的情况。

1.10 统计学处理

实验结果用(均数±标准差)表示，使用SPSS 19.0进行统计学分析，使用GraphPad prism software 5.0作图。各组数据首先进行正态分布检验和方差齐性分析，根据检验结果，采用Mann-WhitneyUtest或Student’st-test检验进行两两比较。P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 桦树花粉诱导的哮喘模型和特异性免疫治疗

桦树花粉致敏和激发的BALB/c小鼠，sRAW较对照组明显升高，特别是在乙酰胆碱浓度为25和50 mg/ml时(P<0.01);经特异性免疫治疗后，sRAW在25和50 mg/ml处明显降低(图2)。

图 2 特异性免疫治疗前后气道高反应变化Fig 2 Changes of airway hyper-responsiveness before and after SCITsRaw:比气道阻力； SCIT:特异性免疫治疗；与对照组比较，*P<0.01；与哮喘组比较，#P<0.01

哮喘小鼠血清sIgE，sIgG1和sIgG2a水平显著高于对照组小鼠P<0.01。经特异性免疫治疗后，sIgE水平降低，sIgG1和保护性抗体sIgG2a水平无明显变化(图3)。

图 3 特异性免疫治疗前后免疫球蛋白水平变化

Fig 3 Changes of specific immunoglobulins before and after SCIT

SCIT:特异性免疫治疗；与对照组比较，*P<0.01；与哮喘组比较，#P<0.01

肺组织病理H&E染色发现哮喘小鼠支气管周围有大量炎性细胞浸润，形成多层细胞环，同时伴有气道增厚和水肿。特异性免疫治疗组小鼠肺部气管周围炎性细胞浸润较少，气道水肿减轻(图4)。

肺组织AB-PAS染色发现：相比对照组小鼠，哮喘小鼠气道壁广泛被染成蓝紫色，气道内也可以看到弥散的蓝紫色，表明产生大量的黏液。特异性免疫治疗组黏液分泌较少(图4)。

2.2 小鼠不同时期Th17数量和Rorc mRNA表达的变化

流式细胞术检测结果显示，哮喘组小鼠脾Th17细胞数量(0.37±0.16)较对照组小鼠脾Th17细胞数量(0.18±0.86)明显增高P<0.05；特异性免疫治疗组，Th17细胞数量(0.16±0.16)较哮喘组显著降低P<0.01(图5)。哮喘组小鼠脾Th17细胞转录因子Rorc的表达量(3.99±1.39)较对照组(1.79±1.19)显著升高(P<0.01)。经特异性免疫治疗后，Th17细胞转录因子Rorc表达量(0.65±0.23)较哮喘组明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义。哮喘小鼠血清细胞因子IL-4和IL-17A表达量均较对照组明显增高。特异性免疫治疗后，细胞因子IL-4和IL-17A水平明显降低(图6)。

3 讨论

季节性过敏性哮喘患病率逐年增加，已成为全球健康关注的问题之一。花粉是引起季节性过敏性哮喘的主要原因，受多种危险因素的影响, 如突发恶劣天气和地区分布等[11]。桦树花粉是中国北方地区春季重要致敏花粉，是过敏性哮喘的重要病因之一[12]。

针对桦树花粉诱导的过敏性哮喘，回避过敏原是最主要的预防措施。此外，抗组胺药物，白三烯抑制剂和糖皮质激素都可用于缓解过敏性哮喘症状。然而，只有特异性免疫治疗能长期控制症状，减少吸入激素的用量，改变过敏性哮喘的自然进程[13]。特异性免疫治疗停止后，仍有长期疗效存在。针对桦树花粉特异性免疫治疗的研究对诊治过敏性哮喘意义重大。由于临床研究的复杂性和众多不可控影响因素，本实验使用哮喘动物模型进行相关研究。

图 4 特异性免疫治疗前后肺组织病理所见

Fig 4 Pulmonary histopathology before and after SCIT

SCIT:特异性免疫治疗

图 5 流式细胞仪检测特异性免疫治疗前后CD4+IL-17A+Th17 细胞

Fig 5 Flow cytometry analysis: CD4+IL-17A+Th17 cell before and after SCIT

SCIT:特异性免疫治疗

图 6 特异性免疫治疗细胞因子水平变化Fig 6 Changes of cytokines in serum before and after SCITSCIT:特异性免疫治疗；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与哮喘组比较，#P<0.01

特异性免疫治疗主要通过诱导免疫耐受，从而缓解过敏性哮喘症状。在本实验中，特异性免疫治疗组能有效缓解小鼠气道高反应，降低Th2型免疫相关的细胞因子水平(IL-4作为Th2型免疫反应细胞因子[14-15]，随着特异性免疫治疗的进行逐渐降低)。同时，特异性免疫治疗能刺激机体产生保护性抗体sIgG2a，与特异性IgE竞争，从而抑制肥大细胞的活化，减少生物活性物质的合成和释放，如组胺、类胰蛋白酶、血小板活化因子和前列腺素D2等[16]。但效果不明显，可能与治疗时间过短有关。本实验结论与既往研究结果[17-18]一致，证明动物模型建立成功。

除了Th2型炎症，新出现的IL-17A及其产生细胞Th17也被认为参与哮喘发病[8,19]。Th17细胞是机体重要的免疫调节细胞。Th17细胞受转录因子Rorc调控，分泌细胞因子IL-17，包括(IL-17A～F) 6种亚型[10]。本研究结果显示，哮喘小鼠的脾Th17数量，转录因子Rorc水平和血清主要效应分子IL-17A水平均明显高于对照组小鼠。但特异性免疫治疗后相应数值均降低，说明特异性免疫治疗可以抑制Th17型免疫炎症反应，符合免疫调节的一般规律。该实验不足之处：其一，还缺少对Th17细胞的拮抗细胞Treg的数量和功能变化的探究。其二，还需要进一步对Th17细胞下游信号通路的研究。

本研究还发现，相比对照组，细胞因子IL-17A和IL-4水平在哮喘组明显升高，经特异性免疫治疗后下降。这可作为桦树花粉特异性免疫治疗相关的生物标志物，但仍需要进行下一步验证。血清细胞因子检测使用xMAP技术为基础的高通量多因子检测平台Luminex200TM，xMAP技术是液相芯片实现多重检测的基础。Merck Millipore联合Luminex®已应用于许多研究的多重生物标志物检测[20-21]。

综上，桦树花粉是我国北方地区春季主要致敏花粉，不仅会引起过敏性鼻炎、过敏性哮喘，还会并发多种食物过敏反应。特异性免疫治疗能改善患者症状，维持长期疗效。桦树花粉相关特异性免疫治疗能部分抑制Th17细胞的数量和功能。