脂肪酸结合蛋白4/5双重抑制剂的研究进展

韩立帅，吴文珍，袁浩亮，孙宏斌，温小安

（中国药科大学 江苏省代谢性疾病药物重点实验室，江苏 南京210009）

近年来，肥胖及相关代谢性疾病已严重威胁到人类的身体健康和生活质量，包括2型糖尿病、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝炎、高血压和冠心病等[1]。脂质代谢异常及慢性低度炎症是代谢性疾病发生发展的重要原因[2]。当人体脂肪过度累积，其沉积在内脏脂肪组织和非脂肪组织（如骨骼肌、肝和胰腺等）中进而引起脂毒性[3]。在脂质代谢紊乱状态下，过量的二酰甘油（diacylglycerol，DAG）及游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）能够激活核转录因子κB抑制蛋白激酶 β（nuclear factor-κB kinases β，IKK-β）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和蛋白激酶R（protein kinases R，PKR）等通路而诱发炎症反应，并导致胰岛素抵抗[4]。脂肪酸结合蛋白（fatty acidbinding proteins，FABPs）作为细胞内脂质伴侣蛋白，尤其是FABP4在调节脂质代谢与炎症通路中发挥重要作用[5]。小鼠敲除FABP4（FABP4-/-）能够保护肥胖引起的胰岛素抵抗[6]，改善血脂异常，降低血浆三酰甘油（triglyceride，TG）和胆固醇水平[7]。此外，载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）缺失的FABP4-/-小鼠也表现出对动脉粥样硬化的保护作用[8]。随着研究的深入，人们发现FABP5能够在FABP4-/-的脂肪细胞中代偿性地表达上调[6]，而FABP4/5双敲除（FABP4/5-/-）小鼠对胰岛素抵抗和血管病变的保护作用更加显著[9-10]。因此，对FABP4/5双重抑制剂的研究逐渐成为热点。本文综述FABP4/5双重抑制剂的最新研究进展，以期为设计全新结构的FABP4/5双重抑制剂提供参考依据。

1 脂肪酸结合蛋白概述

FABPs是一类低相对分子质量（14 000 ～ 15 000）的脂质伴侣蛋白，含126 ～ 134个氨基酸残基，在细胞内与脂肪酸可逆结合，促进脂肪酸的转运和利用。FABPs对花生四烯酸、脂多糖、血红素等疏水性配体也具有很高的亲和力[油酸：Ki(FABP4)=（185±35）nmol · L-1，Ki(FABP5)=（248±12）nmol · L-1； 棕 榈 酸：Ki(FABP4) =（336±164）nmol · L-1，Ki(FABP5)=（802±336）nmol · L-1][11-12]。1972 年 Ockner等[13]首次在大鼠空肠中发现了脂肪酸结合蛋白。目前，在哺乳动物中至少发现9种FABPs亚型，根据其首次被发现的组织或其高表达的特定组织分别命名为肝脏型（FABP1，liver-FABP，L-FABP）、 肠 型（FABP2，intestinal-FABP，I-FABP）、心脏型（FABP3，heart-FABP，H-FABP）、脂肪型（FABP4，adipocyte-FABP，A-FABP）、表皮型（FABP5，epidermal-FABP，E-FABP）、回肠型（FABP6，ileal-FABP，Il-FABP）、脑型（FABP7，brain-FABP，B-FABP）、髓磷脂型（FABP8，myelin-FABP，M-FABP）和睾丸型（FABP9，testis-FABP，T-FABP）[14]（见表1）。这些亚型的一级结构差别很大，同源性仅在15% ～ 70%之间，但它们均有相似的三维结构，由2个α螺旋和10个β折叠组成，并以螺旋-卷曲-螺旋的结构域作为帽子结构覆盖顶部，形成一个配体结合口袋。配体由门区域进入蛋白口袋后，与口袋底部的一个酪氨酸（Tyr）和2个精氨酸（Arg）残基形成关键的氢键作用（见图1）[5]。

表 1 脂肪酸结合蛋白家族Table 1 The FABP family

图 1 FABP4与棕榈酸（C16∶0）共晶结构（PDB：2HNX）Figure 1 Co-crystal structure of human FABP4 with palmitic acid（PDB：2HNX）

FABPs在细胞中与脂质结合，增加脂质水溶性并促进其转运而发挥生理功能（见图2），包括将其转运至脂滴贮存能量；转运至内质网进行信号传导以及膜结构的形成；转运至线粒体和过氧化物酶体进行β-氧化；转运至胞质中调节酶的活性；转运至细胞核与核激素受体（hormone nuclear receptor，NHR）结合并调节相关基因转录[14]。随着研究的深入，人们发现FABPs还可以作为脂肪因子以自分泌或旁分泌的方式影响周围组织和器官的生理功能[24]。另外，FABPs在调节糖脂代谢、介导炎症反应及正常细胞癌变等生理和病理过程中也发挥着重要的作用[5]。

图 2 细胞内脂肪酸结合蛋白的功能Figure 2 Functions of intracellular FABPs

2 脂肪酸结合蛋白4/5与疾病的关系

FABP4又称A-FABP或aP2，主要分布在脂肪细胞和巨噬细胞中，占脂肪组织蛋白总量的1%。1996年，Hotamisligil等[6]首次报道FABP4-/-小鼠在正常饮食情况下与野生型小鼠在表型上并无差异，但在高脂饮食等代谢应激的条件下表现出良好的胰岛素敏感性。与对照组相比，FABP4-/-小鼠的脂肪组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）表达显著下调。随着多种FABP4-/-细胞及动物模型的建立[7-8,25-26]，以及大量流行病学研究发现在2型糖尿病和动脉粥样硬化患者血浆中FABP4高表达[27-29]，人们逐渐认识到FABP4在代谢性疾病中的重要作用。

FABP5又称E-FABP、PA-FABP或mal1，其广泛存在于多种组织中，且在表皮细胞中表达最多，在脂肪细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及乳腺、脑、肾、肝、肺和睾丸等组织中也有表达。由于上述组织中同时有其他FABP亚型的表达，因此，FABP5的确切功能仍有待进一步阐明[14]。

为了更好地理解FABP4和FABP5在脂质代谢中的作用，研究者用FABP4-/-小鼠与FABP5-/-小鼠杂交，获得了FABP4/5-/-小鼠[9]。FABP4/5-/-小鼠相对于FABP4或FABP5单敲除小鼠具有更好的代谢表型：其不仅能够抵抗髙脂饮食诱导的肥胖，增加胰岛素敏感性，维持葡萄糖稳态，还能够增加肌肉组织中腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的磷酸化水平，减少肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）的表达，改善肝脏的脂质浸润，对高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性具有保护作用。ApoE-/-/FABP4/5-/-小鼠与ApoE-/-/FABP4-/-小鼠相比，其降低血管病变效果更加显著，并且在高脂饮食喂养下FABP4/5-/-能提高小鼠存活率[8,10]。分子机制研究表明，在FABP4-/-巨噬细胞中，过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）活性增强，可能通过PPARγ-肝X受体（liver X receptor，LXR）-α-ATP-结合转运体 A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）通路促进胆固醇外流，减少细胞内脂质的沉积，防止泡沫细胞的形成[30]。但在FABP5-/-巨噬细胞中，PPARγ活性也会升高[31]。PPARs和FABPs间的联系在不同情况下产生的效应也不尽相同。FABP4依赖于脂肪酸与激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）结合并激活HSL，促进脂质分解，抑制脂肪的生成。在FABP4-/-小鼠的脂肪组织中发现脂质分解减少[32-33]，其作用与PPARγ相反。PPARγ能增加FABP4的表达，并受到FABP4的负反馈调控。此外，FABP4能够提高PPARγ的泛素化水平，加速蛋白酶体对PPARγ的降解作用[34]。因此，最终表现为FABP4能够抑制PPARγ的活性。尤其值得注意的是，FABP4和FABP5能够介导炎症反应。在FABP4-/-巨噬细胞中，核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路上游的IKK-β激酶的磷酸化被抑制，环氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）的表达降低，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）分泌显著减少[30,35]，降低炎症反应。同时，FABP4能够与JNK-AP-1形成正反馈调节而加强脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症反应[36]。另外有研究表明，FABP4和FABP5能够与白三烯A4结合，增加其化学稳定性，从而促进炎症发生发展[37-38]。这些均表明FABP4/5在脂质代谢和炎症反应中扮演重要的角色。FABP4和FABP5还与多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等的发生发展以及肿瘤代谢密切相关[39]。因此，FABP4和FABP5被认为是治疗肥胖及相关代谢性疾病甚至肿瘤的潜在靶标。目前，已有多种FABP4小分子抑制剂被报道。对于FABP4/5双重抑制剂的研究报道也越来越多。另一方面，FABP3亚型主要在心脏中表达。研究表明：FABP3-/-小鼠会出现运动不耐受，且在老年时发生局部心肌肥厚现象，也就是说，抑制FABP3可能会导致心脏毒性[40]。因此，开发具有选择性的FABP4/5双重抑制剂更具优势和应用价值。

3 脂肪酸结合蛋白4/5双重抑制剂

3.1 芳基喹啉类及双环吡啶类

2013年，Ceccarelli等[41]在专利中公开了一类以喹啉为母核的化合物（化合物1～6），并用时间分辨荧光共振能量转移（time resolution fl uorescence resonance energy transfer，TR-FRET）方法检测了它们对FABP4和FABP5蛋白的抑制活性（见表2），其中化合物1活性最好，其对FABP4和FABP5的IC50分别为13和51 nmol · L-1。

表 2 化合物2～6对FABPs抑制活性（Ki 值）Table 2 The inhibitory activities( Ki value) of compounds 2～6 on FABPs（hFABP3, hFABP4, hFABP5）

2016年，Kühne等[42]报道了上述喹啉类化合物的研究过程。化合物2是通过虚拟筛选得到的苗头化合物，具有较强的FABP3抑制活性，且没有FABP5抑制活性。但化合物2具有较好的水溶性和渗透性，且在人源和鼠源肝微粒体内清除率较低，具有进一步改造的价值。化合物2与FABP4的共晶结构（见图3a）显示，其占据疏水口袋，羧酸部分与Arg127形成直接的氢键作用，并通过两分子水与Tyr129形成间接的氢键作用，其他部分处于一个由Phe17、Tyr20、Met21、Val26、Thr30、Ala37、Pro39、Phe58、Ala76、Asp77 和 Ile105等氨基酸残基围成的疏水空腔中，并与周围氨基酸形成多个π-π 堆积作用和色散作用。将化合物2与FABP4的共晶结构与已知FABP3、FABP4、FABP5的共晶结构（PDB ID: 2HMB、 2HNX、1B56）叠合，比较关键位点氨基酸序列的差异，基于结构进行分子设计与优化，得到一系列化合物。将化合物2的2位甲基换成异丙基或哌啶分别得到化合物3和5，其对FABP3的抑制活性明显降低，并提高了对FABP5的抑制活性。分析蛋白复合物结构（见图3b）发现，此位点在FABP4和FABP5蛋白中对应的氨基酸残基为异亮氨酸、缬氨酸和半胱氨酸，而在FABP3中是3个体积较大的亮氨酸。推测在FABP3中形成的结合口袋较小，不利于与大基团的结合。因此，可以通过在喹啉母核2位引入如异丙基或哌啶等体积较大基团，以降低对FABP3的抑制活性，进而实现选择性。在化合物3的苯环3位引入异丙基得到化合物4，其对FABP3的抑制活性显著降低，对FABP5的抑制活性也略有降低，而对FABP4的抑制活性影响不大。在蛋白晶体结构中，此位点在FABP4蛋白上对应54位丝氨酸，而在FABP3和FABP5中则是体积较大的苏氨酸，因此，当引入如异丙基等较大基团时，能够显著降低化合物对FABP3和FABP5的抑制活性，而对FABP4影响较小；同时还发现异丙基的引入能够与FABP4氨基酸残基（Pro39、Thr61）产生色散作用，增强其与FABP4的相互作用（见图3c）。最后，将化合物5的羧酸部分利用生物电子等排替换成四氮唑得到了化合物6（RO6806051）。在化合物6与FABP5的共晶结构（见图3d）中，四氮唑不仅能够与关键氨基酸Arg129及Tyr131形成氢键作用，同时还能与FABP5的Thr56氨基酸残基的Cγ产生色散作用，增强其对FABP5的抑制活性。化合物6目前处于临床前研究阶段，主要用于治疗动脉粥样硬化，但其成药性有待进一步探究。

图 3 芳基喹啉类化合物与脂肪酸结合蛋白共晶结构Figure 3 Co-crystal structures of human FABPs in complex with aryl-quinoline derivatives

2014年，Buettelmann等[43]公开了一类双环吡啶类化合物。该类化合物具有较强的FABP4/5双重抑制活性，其结构与喹啉类较为相似。利用TR-FRET方法测定吡啶类化合物7对FABP4和FABP5的IC50均达到20 nmol · L-1，但尚未报道此类化合物对FABP3的抑制活性。

3.2 三唑并嘧啶酮类

2011年，Lan等[44]报道了一类三唑并嘧啶酮类FABP4/5双重抑制剂（化合物8、9和10）。该类化合物为非羧酸类FABP4/5抑制剂，具有良好细胞渗透率和药代动力学性质。利用温度依赖性荧光法（temperature-dependent fl uorescence，TdF）筛出化合物8，经过结构改造得到化合物9和10。相关化合物蛋白抑制活性见表3。

表 3 化合物8～10对脂肪酸结合蛋白抑制活性（Kd或IC50）Table 3 Inhibitory activities (Kd or IC50 ) of compounds 8～10 on FABPs

FABP4能够促进脂质分解，而化合物9和10能剂量依赖性地抑制异丙肾上腺素刺激的鼠源3T3-L1脂肪细胞和人原代脂肪细胞的脂肪分解。化合物9和10还能抑制THP-1细胞和人原代巨噬细胞释放单核细胞趋化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），具有潜在的抗炎作用。动物实验中，化合物10可以降低髙脂饮食诱导肥胖小鼠血浆中TG和FFA水平，改善肥胖小鼠的脂质代谢异常，但并没有明显提高其糖耐量，也不能改善胰岛素抵抗[44]。

3.3 其他类型的FABP4/5双重抑制剂

2003年，百时美施贵宝公司公开了一类芳基化合物。利用8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，1，8-ANS）荧光位移法测得其代表性化合物11（BMS-480404）对FABP4和FABP5的Ki分别为2.5和33 nmol · L-1[45]。此类化合物主要用于抗血脂异常和糖尿病的活性研究。

2012年，默克公司和药明康德公司公开了化合物12的结构，其对FABP4和FABP5的IC50分别为455和850 nmol · L-1[46]。在高脂饮食诱导的肥胖C57小鼠中，化合物12能改善胰岛素抗性和葡萄糖耐受，并降低循环TG的水平，用于治疗脂质异常和糖尿病，目前处于临床前研究阶段。

Buettelmann等[47-48]分别在2013年和2014年公开了2类噻吩酰胺类化合物。用TR-FRET法测得其代表性化合物13对FABP4和FABP5的IC50分别为9和34 nmol · L-1，化合物14对FABP4和FABP5的IC50分别为 13和 16 nmol · L-1。此外，Buttelmann 等[49]还报道了一种脲类化合物，其具有较强的FABP4/5双重抑制剂活性，其中活性最好的化合物15对FABP4和FABP5 的 IC50分别为 50 nmol · L-1和 3.79 μmol · L-1。

4 FABP5小分子抑制剂

目前，关于FABP5小分子抑制剂的报道很少。随着对FABP5研究的不断深入，人们发现FABP5不仅在炎症反应中发挥重要作用[50-51]，还能够促进包括宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤的生长、转移和侵袭[52-55]。因此，对FABP5抑制剂的开发也逐渐受到关注。本节主要介绍已报道的FABP5小分子抑制剂，期望对FABP4/5双重抑制剂的开发有所帮助。

2012年，Berger等[56]报道了一类古柯间酸单酯类化合物（化合物16和17），其中化合物16（SB-FI-26）对 FABP5 的 Ki值 为（0.9±0.1）μmol · L-1， 同 时 对FABP3 和FABP7也具有一定的抑制活性，Ki值分别为（3.9±0.7）和（0.4 ± 0.0）μmol · L-1。在人脑中，内源性大麻素（endocannabinoid anandamide，AEA）有利于缓解应激、疼痛和炎症；而FABPs能够与其结合并转运到内质网，在脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAHH）作用下水解失活[56]。因此，抑制FABPs能够降低细胞对AEA的摄取，减少AEA降解，升高脑中AEA水平，产生镇痛抗炎作用[56]。在体内外实验中，化合物16也具有类似作用，可抑制海拉细胞摄取AEA，并且能够升高疼痛模型小鼠脑中AEA水平，具有镇痛抗炎效果[56]。2018年，Bogdan等[50]发现FABP5能够激活微粒体前列腺素E合酶-1（microsomal prostaglandin E synthase-1，mPGES-1）， 促 进 PGE2的生物合成，在炎症反应中发挥重要作用。化合物16能够抑制FABP5，降低mPGES-1和PGE2的表达，达到镇痛抗炎的效果。除了镇痛抗炎作用外，2017年，Al-Jameel等[57]报道化合物16能够通过FABP5-PPARγ-VEGF通路治疗去势抵抗性前列腺癌。化合物16通过抑制FABP5，减少细胞对胞外脂肪酸的摄取以及胞内脂质降解生成的脂肪酸，逆转过多的脂肪酸引起的PPARγ激活和VEGF产生，来抑制肿瘤的发展。

为了提高活性、水溶性、选择性以及体内稳定性，研究人员对化合物16进行进一步的结构改造与构效关系研究[58]。化合物16与FABP5的共晶复合物显示，化合物16的羧基与FABP5的2个关键氨基酸残基Arg129和Tyr131形成直接的氢键作用，并通过1个水分子与Arg109形成4个间接的氢键作用（见图4a）。研究人员还发现化合物16除了上述与FABP5经典配体结合模式外，还能与蛋白的底物入口门区域结合（见图4b）。化合物16对FABP7也具有较好的抑制活性。在化合物16与FABP7的复合晶体结构中，其羧基不仅能够与相应的Arg127形成盐桥，还通过1个水分子与Arg127、Tyr129、Arg107及Thr54等关键氨基酸形成氢键作用，从而增强其抑制活性。与脂肪酸和FABP7的共晶结构不同，化合物16的羧基部分还能够通过1个水分子与FABP7的Gly34和Thr37的羰基氧及Arg127的NH基团形成4个氢键，而这在以脂肪酸为配体的共晶结构中并不存在。化合物16的2个苯环位于FABP7的疏水氨基酸Phe17、Met21、Leu24、Val26、Thr30、Pro39、Phe58、Ala76、Phe105、Met116和Leu118形成的疏水空腔中（见图4c）[59]。通过一系列构效关系研究， Yan等[58]获得了FABP5选择性抑制剂化合物 17（对 FABP5 的 Ki为 1.72 μmol · L-1,对 FABP3 和 FABP7 的 Ki均大于 10 μmol · L-1）。在弗氏完全佐剂诱导大鼠炎性痛模型中，化合物17表现出强效的镇痛作用。

图 4 化合物16与脂肪酸结合蛋白共晶结构Figure 4 Co-crystal structures of human FABPs in complex with compound 16

5 结语

FABPs在脂质代谢调节中发挥重要作用，与代谢性炎症疾病密切相关。过度的能量摄取及长期的能量过剩等多种不良生活方式促进了糖尿病、高血脂症、动脉粥样硬化等代谢性炎症疾病的发生发展。FABP4/5-/-小鼠模型及大量流行病学的研究均表明，FABP4/5双重抑制剂在治疗代谢性炎症疾病方面可能更具优势，有可能成为代谢性疾病药物研发的一个重要方向。目前，一方面，针对FABP4/5双重抑制剂的研究报道较少，且尚未有化合物进入临床研究，FABPs的生物学功能及作用机制也有待进一步阐明。另一方面，FABPs各亚型之间在三级结构上相似性较高，这给研制特异性的FABP4/5双重抑制剂带来一定的挑战。总之，研制高活性和高特异性的FABP4/5双重抑制剂具有重要的理论研究意义和临床转化价值。