根系分泌物抑制连作障碍线虫病的根际调控机制及其应用

刘彤彤，卢巧芳，王男麒，王天琪，刘环环，左元梅

（中国农业大学资源环境学院/国家农业绿色发展研究院/教育部植物-土壤互作重点实验室，北京 100193）

1 我国农业生产中连作障碍问题突出

连作障碍是指即使在正常的栽培管理措施下，同一片土地连续种植两茬及以上同种同属作物而出现病害、缺素，进而大幅减产甚至绝产的现象。连作障碍广泛存在于大田经济作物及设施蔬菜、观赏花卉、果树等植物生产过程中。连作栽培条件下，根系分泌物在根部连续积累，引起土壤理化性质发生变化[1]，土壤微生物群落结构紊乱[2]，土壤线虫群落多样性程度降低[3]。

1.1 连作障碍种植面积和作物比例较高

国外将连作障碍称为再植病害 (replant disease)。国外地多人少，成熟的现代化耕作技术使国外农场主从源头主动避免连作障碍[4]，而中国是地少人多型农业大国，耕种模式传统，各区域有传统耕种作物，例如新疆的棉花、黑龙江的大豆和马铃薯、河南的花生、山东的设施蔬菜、广东和广西的香蕉、云南的三七和烤烟，这些特色农产品因当地种植习惯、经济利益驱使而常年单一种植。

将出现连作障碍的作物分为三大类，包括大田经济作物 (水稻、大豆和玉米等)、设施园艺作物 (瓜果蔬菜和观赏花卉) 和中草药。据中国统计局(2014年)统计，黑龙江省的大田经济作物输出量为全国第一，河南和山东分别居第二和第三位。设施园艺作物因大棚自动化越来越高而逐年扩大种植面积，山东、河南、江苏的蔬菜产量分别居全国的前三位。中草药的种植面积以湖南省最多，其次为贵州、甘肃。根据各地传统作物分布和作物输出量统计分析，发现各省传统作物有最高输出量的基本规律。

按照各省耕地面积将各省份连作障碍出现概率分级，根据连作障碍分级情况和三类作物耕地面积所占比例绘制图1。由图1可见，黑龙江省、山东省、河南省成为易患且已患连作障碍重灾区，其它省份也遭受不同程度的连作障碍，同时大田经济作物最易患连作障碍。

1.2 连作障碍发生规律呈“抛物线”状

对比不同作物，发现传统中药最易遭受连作障碍，大田经济作物较耐受连作障碍 (图2)。根茎类中药 (三七) 连作2年，重茬幼苗死亡率达100%[5]；香蕉连作10年左右，产量可恢复与非连作蕉园一致[6]；大豆连作15年与连作2年产量无显著差异[7]；棉田连作20年病情指数最高[8]。分析以上作物在连作条件下，产量开始降低年份、产量最低年份及产量恢复至等同正茬年份的规律 (图2)，发现连作障碍规律呈“抛物线”状。作物产量随连作年限延长而降低，低至最低产量后，作物产量出现回升趋势，出现自我调节现象。这种连作障碍的自我调节能力受土壤类型、耕种作物、人为施肥等因素的影响而不同。因此，在恰当时机针对性地选择合理方式解决连作障碍需要大量的研究成果作为理论支持，利用作物连作障碍规律调控作物种植年限是控制连作障碍最直观的方式。

图1 中国连作障碍出现概率等级划分和不同种类作物耕种面积分布示意图Fig.1 Replant disease levels and percentage of cropping areas of different crops in China

图2 不同作物长期连作后产量随连作年限变化规律Fig.2 Regulation of different crop yields with long term continuous cropping years

2 根系分泌物对连作线虫病具有重要的根际调控作用

2.1 连作作物单一根系分泌物积累易导致连作障碍

连作栽培情况下，单一根系分泌物累积在作物根际，土壤酸化，土壤内线虫和微生物多样性均降低，根际生态平衡被打乱，根际有害微生物在酸性条件下大量繁殖，土壤由“细菌型”转变成“真菌型”，由“健康型”转变成“致病型”，土壤微生物新陈代谢的整体活性降低，造成土壤酶活性降低，元素发生“木桶效应”；植物寄生线虫丰度在土壤内大幅上升，广泛引发线虫病，且导致复合真菌/细菌病害发生，并连同植物根系分泌的自毒物质一起影响植株代谢，对植物生长有很大的影响，最后导致作物患病，产量降低 (表1)。

2.2 连作造成植物寄生线虫病害严重

连作引起的线虫病在全国有不同程度地发生。山东寿光是中国蔬菜基地，番茄、黄瓜等设施蔬菜极易感染南方根结线虫[28]，且于新疆地区发现南方根结线虫在设施蔬菜土壤中为优势种[29]。云南三七易遭受北方根结线虫侵染，导致三七品质和产量降低[30]。南方根结线虫 (Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫 (Meloidogyne javanica)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria) 和北方根结线虫 (Meloidogyne hapla) 占根结线虫属的95%，其中南方根结线虫M.incognita占比最多，分布最为广泛[31]。孢囊线虫可毁灭性危害甜菜、大豆及水稻等。在大豆生产国均有大豆孢囊线虫病发生，使大豆减产5%～20%，甚至绝产，我国每年受害面积达2.67 × 106hm2，危害程度和面积逐年发展。

植物寄生线虫是最具破坏性的植物病原之一，宿主范围大于3000种作物，线虫侵染加重作物根腐病、枯萎病、立枯病等，致使全球每年损失达157亿美元[32]，因此防治线虫病害任务日益加重。

2.3 防控线虫病的关键方法和措施

防治线虫病的方法包括化学、物理、农业和生物方法 (图3)。使用化学杀线剂污染环境易残留，采用热、电消毒的物理方法繁琐不持续，间作、轮作等不适用于所有农作物，而间作、轮作体系中所发现的特殊根系分泌物，配置成生物源功能肥料的生物方法才是发展可持续农业的最佳选择。未来开发植物源杀线虫功能物质进行根际调控是研究的热点之一，根际调控作为一种新的农业技术手段[33]，对农业生产起着日益重要的作用，利用抗性植物和非寄主植物根系分泌物或特殊作物残茬提取物，结合有益微生物配制生物功能肥料 (bio-fertilizer)，进行根际调控可高效缓解连作障碍。

表1 不同作物连作障碍因素、自毒物质、严重年限及表现Table 1 Factors, autotoxic substance, serious years and performance of different crops of catched replant diseases

3 利用根系分泌物介导实现对线虫识别和侵染的抑制

3.1 根系分泌物在植物根际的生理生态调控作用

根系分泌物是根系在生命活动过程中由根组织向土壤中持续释放化合物的总称。根系分泌物包括：离子、氨基酸、酰胺类、糖类、有机酸、酚酸类，及多种次级代谢物[34]。在根际土壤中，根系分泌物与土壤生物互作，植物既可调节其根际化学组成来促进微生物的生长，从而提高其在特定生态系统中的适应性[35]；也可因微生物代谢对底物的偏好改变植物根系分泌物组成[36]。长期连作，单一根系分泌物积累于根际，造成特异微生物、线虫富集，从而引起连作微生物病害、线虫病害，甚至复合病害。但抗性植物和非寄主植物的根系分泌物在抵御病原菌和植物寄生线虫方面表现出较好的前景。

通过GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)、X射线CT (电脑断层扫描) 和MRI (磁共振成像) 可视化技术鉴定根系分泌物[37]，利用特殊根系分泌物对根结线虫进行根际调控能够为线虫防治提供理论依据，还可土壤生物-植物间互作提供新的认知。结合分子手段对土壤微生物测序，通过基因功能预测了解微生物对代谢物底物偏好，进而调控根际微生物群落组装模式，可改善作物根际微生态环境。同时了解线虫如何识别寄主，掌握不同根系分泌物对线虫的根际调控效果及其机制将有效防治线虫病害；线虫群落结构及多样性分析也已进入分子分析阶段，为连作线虫病害的分析和治理提供了科学的理论基础[38]。

图3 防治连作障碍线虫病的关键方法和措施Fig.3 Selection of methods for controlling replant nematode disease

3.2 线虫依靠根系分泌物识别寄主

线虫生命周期有6个阶段：卵―幼虫 (J1、J2、J3和J4)―成虫。线虫从卵发育到J1、J2时期寻找合适的根系寄生，仅在 J2 时期通过头部两侧对称的化感器及侧腹尾感器[39]受寄主根系分泌物的刺激[40]具备侵染能力 (图4)。

当根结属J2幼虫靠近寄主植物时，线虫食道腺分泌蛋白降解根细胞细胞壁，线虫进入根内，食道腺分泌分泌物使导管细胞膨胀并加快周围细胞分裂，从而形成巨型细胞，最终形成根结。南方根结线虫在温度20～30℃和湿度40%～70%时完成一个世代约需30～60天，在适宜的环境条件下，根结线虫每年可形成5～10世代。南方根结线虫以幼虫在土中和卵在病根的根结内休眠越冬，次年气温升到10℃左右时，越冬卵开始孵化成为幼虫进入土壤，进入土壤的J2幼虫寻找寄主植物，完成侵染。

图4 利用根系分泌物结合根结线虫发育关键时期控制线虫病害机理图Fig.4 Mechanism of root exudates-mediated root knot nematode disease

孢囊属J2幼虫穿刺进入根中，从寄主根系幼嫩组织侵入皮层直到中柱，18 天后雌成虫身体膨大，卵巢中充满卵[41]。当寄主根系衰老，卵囊中的卵不再孵化，雌虫死亡，体壁硬化，转变成孢囊，成熟孢囊脱落于土中而成为再侵染源。有报道称，大豆孢囊线虫雌雄交配会发生基因交换，即使种植单一抗性品种，也可能造成同一群体中弱势小种变异为优势小种，即引起生理小种致病性变异，从而使该作物抗性丧失[42]。因此，选择持续长久的防治方法非常重要。

有大量研究证明，易感作物根系分泌物使线虫产生趋向性，促进虫卵孵化。易感大豆根系分泌的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸可吸引大豆孢囊线虫[43]；柑橘根系分泌的α-松萜、柠檬烯和β-松萜等萜类物质可吸引柑橘根结线虫[44-45]。

3.3 根系分泌物调控线虫识别、侵染的生物学机制

植物根际与线虫互作，具有侵染能力的J2幼虫具有一系列可以响应根系分泌物活性物质的嗅觉神经元。因此，通过破坏J2幼虫向寄主植物的趋向性及运动，是减轻线虫病害的有效措施之一，线虫的二龄期成为化学信号调控的重要时期。

南方根结线虫中42.1%基因与秀丽线虫是直系同源基因，这些基因与根结线虫的生育相关，成为药物防治的靶基因[46]。FMRFamide-like peptides(FLPs) 是根结线虫最大神经递质之一，“FLP作为重要的信号传导途径之一”已在植物与线虫的互作过程中取得巨大进展。FLP信号途径与G-蛋白偶联受体 (G-protein coupled receptors GPCR 亚类型X1-X5) 相关，启动下游第二信使，控制根结线虫运动、取食、肌肉组织的再生及神经调节[47]。

孢囊线虫的Ror毒力基因可控制线虫产生纤维素酶和果胶裂解酶裂解植物根系细胞壁，进而通过Hg-rbp-2控制线虫的发育和寄生能力[48]，但孢囊线虫雌雄交配产生后代会发生基因交换使线虫生理小种发生变化[49]，因此针对孢囊线虫越来越需要寻找新的抗性基因或扩展抗性背景。

3.4 植物根系分泌物通过根际调控抑制线虫侵染的实践应用

易感作物根系分泌物促进线虫趋向运动和孵化，大豆根系分泌物促进孢囊线虫的孵化，且连作时间越长，大豆患孢囊线虫病越严重[50]；花生根系分泌物影响土壤线虫丰度，分泌物浓度越高，土壤线虫多样性越低[51]。然而，非寄主作物根系分泌物可调控线虫趋向性，抑制卵孵化或致死线虫。董林林等在茼蒿、蓖麻与番茄间作体系中发现茼蒿根系分泌物中月桂酸，蓖麻根系分泌物中棕榈酸和亚油酸对根结线虫有致死效应、抑制线虫孵化，并且在低浓度下吸引线虫杀死线虫，高浓度下趋避线虫[52]。掌握月桂酸、亚油酸和棕榈酸调控Mi-16D10和Mi-flp-18基因表达来抑制线虫侵染与繁殖，从而减轻作物根结线虫病害。钟丽娜发现仙客系列抗性品种番茄的特异根系分泌物浓度大于4 mmol/L时能将25.9%以上的线虫致死，且浓度越高致死能力越强，在低浓度时可抑制线虫的运动能力[53]。选择抗性品种间套作即是利用根系分泌物进行根际调控的原理，调动根际有益微生物，抑制寄生线虫防治连作障碍。同时，特殊植物残渣再利用也可实现根际调控，青蒿、万寿菊、薄荷、紫花苜蓿等几种植物提取物能够有效防治根结线虫[54-55]。但直接施用植物残渣使作物产量降低[56]，可将残渣提取物添加至腐熟堆肥，既可抑制线虫病又可实现作物增产[57]。

利用根系分泌物和特殊作物残渣提取物作为生物源功能物质，配置成生物功能肥料 (bio-fertilizer)进行根际调控，是高效控制连作障碍线虫病害和发展可持续农业的重要手段 (图5)。

4 展望

我国连作障碍现象普遍，单一作物长期耕种，根系分泌物在根际单一积累，扰乱根际微生物群落结构，富集植物寄生线虫。在我国广泛引起线虫病是作物连作中最难治理的土传病害之一。

基于近年来最新的国内外研究进展，针对植物根系分泌物在控制寄生线虫识别侵染植物过程中具有重要的生物学调控作用，面对我国农业生产中作物连作障碍突出的问题，应该在以下几个方面引起重视和突破：1) 针对重要和特定的作物，掌握作物连作发病规律，找到防治连作障碍的关键时期。2)围绕根系分泌物与线虫互作关系探索克服连作线虫病害的方法，为实际生产应用提供最有效的理论依据和技术支撑。3) 筛选抗性植物和非寄主植物特异根系分泌物作为生物源功能物质，为创建无公害植物源杀线剂提供重要依据。同时发挥生态位优势功能微生物、营养调控和土壤外源添加物的根际综合调控，致力于改善土壤微生态环境，克服线虫引起的连作障碍；也可通过分子生物学技术手段监测线虫多样性变化，科学评价不同生态系统的土壤质量。最终，在控制线虫方面揭示植物和线虫在根际间信号传递的分子和生理机制的新信息，发展有效且可持续的控制策略，实现一套全面集成和优化的方法来提高作物产量和营养品质的同时降低作物线虫病；在土壤质量指示生物中实现植物-寄生虫相互作用的整体表达分析，完整评估基于改变土壤线虫群落结构多样性和土壤质量之间的关系。

图5 根系分泌物介导的根际调控克服连作障碍线虫病的生物学机制及其应用Fig.5 Rhizosphere regulatory mechanism of bio-fertilizer reducing replant nematode disease

总之，在理论层面明确以根系分泌物为主导，调控连作障碍的生物学机制的基础上，进一步科学定向调控植物根际的生物学过程，发挥植物-土壤-微生物体系优势互补的生物学潜力，这将对提升土壤健康和促进作物优质高产高效并实现绿色农业和可持续发展具有重要的理论和实践意义，应用前景广阔。