血清及组织内HOTAIR 表达在结肠癌诊断及转移风险识别中的应用价值研究

黎武，宋劲松

天门市第一人民医院普外1区湖北天门431700

结肠癌为40～50岁人群高发的恶性肿瘤之一［1］。相关证据表明［2］，复发及转移是中晚期结肠癌患者死亡的主要原因，即使采取标准治疗方案，5年内复发率仍高达50%。随着研究的深入，有研究发现［3-5］，非编码基因在多种恶性肿瘤的发生、进展与转移过程中均发挥重要作用，如胃癌、大肠癌、胃肠间质瘤等。梁思远的研究发现［6］，长链非编码RNA 参与顺式调控、反式调控、转录激活、核内运输等多种基因转录过程，可作为生物标志物，而异常表达的长链非编码RNA可预测肿瘤的发生与转移。同源基因的转录反义RNA （homeotic genes transcript antisense RNA，HOTAIR）是第1 个被发现的通过表观遗传调控致癌的长链非编码RNA［7］，但目前其在结肠癌发生与转移中的作用机制尚不明确，有关结肠癌患者血清中HOTAIR 表达的相关研究鲜有报道。本研究检测了56 例结肠癌患者的血清及癌组织HOTAIR表达，并将血清HOTAIR表达与健康体检者进行比较，探讨血清及组织内HOTAIR 表达在结肠癌诊断及转移风险识别中的应用价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年1月期间于本院就诊并接受手术的结肠癌患者56 例为研究对象，均经术后病理证实为结肠癌，排除合并其他部位肿瘤者。结直肠癌患者中男性39例，女性17例；年龄45～77岁，平均（60.89±9.58）岁；术后病理判断TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅳ期11例；29例有淋巴结转移，27 例无淋巴结转移。另随机选择同期来本院进行体检的健康体检者56 例为对照组。其中男性35 例，女性21 例；年龄37～72 岁，平均（58.50±9.21）岁。两组性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），具有可比性。研究获医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：（1）病理确诊为结肠癌；（2）年龄40～80 岁。排除标准：（1）既往恶性肿瘤病史；（2）合并心衰、心肌梗死等严重心脏疾病；（3）恶性贫血、感染性疾病等其他严重内科疾病；（4）采集前接受过肿瘤辅助治疗；（5）合并免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 仪器及试剂5×g DNA Eraser buffer、CelmiR-39、gDNA Eraser、2×SYBR Premix Ex Taqtm、PrimeScript Enzyme、Nuclease free H2O（购自大连Ta-KaRa 公司）；氯仿、异丙醇、乙醇均购自重庆川东化工；TRIzol LS（美国Invitrogen公司）；无酶水洗涤核酸蛋白测定仪（美国Thermo公司）；低温冷冻离心机（美国Beckman公司Allagra-64R型）；微量台式高速冷冻离心机（美国Beckman 公司Micro-21R 型）；实时荧光定量qPCR仪（新加坡ABI公司）；Veriti-96型PCR仪（新加坡Life公司）。

1.3.2 组织内样本RNA 提取于术中获取患者结肠癌组织与癌旁正常组织，分割成直径约0.5 cm 的组织块，充分碾磨、混匀，吸取碾磨碗中TRIzol 试剂至无酶离心管内，将200 μL 氯仿试剂，混匀，待10 min 后置于低温高速离心机内，4 ℃，12 000 rmp离心15 min，吸取上清液400 μL在新无酶离心管内，加入400 μL异丙醇溶液，混匀放置8 min，在低温离心机内4 ℃，12 000 rmp 离心10 min，弃上清，将1 mL75%乙醇溶液加入，轻振荡混匀，再置入离心机内4 ℃，7 500 rmp，离心5 min，弃上清，放入低温离心机内4 ℃，7 500 rmp，离心30 s，将多余乙醇吸弃，室温下干燥，每管内加50 μL DEPC无酶水。无酶水洗涤核酸蛋白测定仪检测RNA 溶度，吸取1.5 μL样本至核酸蛋白测定仪内，检测RNA浓度。

1.3.3 血清RNA提取采集结肠癌患者与健康体检者的5 mL 外周静脉血，置于促凝管中，离心（2 500 r/min，15 min）后留取上清液置于无酶离心管，在-80 ℃下保存，室温融化吸取250 μL 在无酶离心管内，将750 μL TRIzol LS试剂，混匀，将10 μL 0.2 μmol/mL 线虫Cel-miR-39，混匀，加200 μL 氯仿试剂，混匀，放置10 min 后在低温高温离心机内4 ℃，12 000 rmp离心15 min，吸取上清液400 μL在新的无酶离心管内，加400 μL 异丙醇溶液，混匀静置8 min，低温离心，4 ℃，12 000 rmp，离心10 min，弃上清，加1 mL 75%乙醇，轻柔振荡混匀，低温离心，4 ℃，7 500 rmp，离心5 min 后弃上清，吸弃多余乙醇，室温干燥，每管加20 μL 65 ℃DEPC无酶水溶液RNA。

1.3.4 qRT-PCR 检测组织内HOTAIR 表达采用qRT-PCR 检测，组织样本总RNA 以无酶水稀释1 μg，根据以下反应体系加入，5×g DNAEraser buffer（2 μL）、 1 μL gDNAEraser （1 μL）、 TotalRNA（1μg），反应条件：混匀，45 ℃，1min，后继续加入试剂：5×PrimeScriptEnzymeBuffer （4 μL）、Prime-ScriptEnzyme （1μL）、PrimeScriptRT Mix （1 μL）、Nucleasefree H2O（4 μL），混匀，37 ℃，15 min，得cDNAs。qPCR扩增条件：2×SYBRPremix Ex Taqtm（5 μL）、PrimerForward（0.2 μL）、Primer Reverse（0.2 μL）、ROXDye Ⅱ（0.2 μL）、Nucleasefree H2O（2.4 μL）、cDNA（2 μL），行ABIstepone扩增，采集荧光。

1.3.5 检测血清HOTAIR 表达逆转录：HOTAIR逆转录引物的上游序列：5'-GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'；HOTAIR 逆转录引物的下游序列：5'-ACACAAAGTGCATACCTACCCA-3'。经逆转录、预扩增（2×SYBRPremixExTaqtm5 μL、PrimerForward 0.2 μL、Primer Reverse 0.2 μL、NucleasefreeH2O 2.6 μL、cDNA 2 μL，混匀，95 ℃，2 min，14 循环后95 ℃15 sec，58 ℃下30 sec，溶解温度，由58 ℃加至95 ℃，获得预扩增产物）、qPCR扩增（2×SYBR Premix Ex Taqtm5 μL、Primer Forward 0.2 μL、Primer Reverse 0.2 μL、Nuclease free H2O 2.4 μL、ROX DyeⅡ0.2 μL，预扩增产物2 μL）、扩增内参（ABI stepone扩增，混匀后95 ℃2 min，40 个循环，在95 ℃反应15 sec，58 ℃反应30 sec，58 ℃时采集荧光，溶解，由58 ℃加至95 ℃，持续采集荧光，每加0.5 ℃采集1次），上述步骤完成后采用Comparative Dleta-delta Ct法测定血清中HOTAIR表达的定量结果，以mRNA相对表达值（HOTAIR/Cel-miR-39）表示。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 癌组织与癌旁正常组织中HOTAIR的表达

癌组织中HOTAIR 的mRNA 相对表达值为（25.41±6.10），高于癌旁正常组织的（6.37±1.59），差异有统计学意义（P ＜0.05）。癌组织和癌旁正常组织HOTAIR荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线如图1。

图1 癌组织和癌旁组织HOTAIR荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线

2.2 临床分期与血清HOTAIR表达的相关性

Ⅲ、Ⅳ期结肠癌患者血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值为（57.20±10.96），高于Ⅰ、Ⅱ期结肠癌患者的（20.21±6.72）与健康体检者的（17.63±5.75），差异均有统计学意义（F = 262.266，P ＜0.001；LSD -tⅢ、Ⅳ期vs.Ⅰ、Ⅱ期=18.461， PⅢ、Ⅳ期vs.Ⅰ、Ⅱ期＜ 0.001；LSD-tⅢ、Ⅳ期vs.健康体检者=22.071，PⅢ、Ⅳ期vs.健康体检者＜0.001）。健康体检者血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值与Ⅰ、Ⅱ期结肠癌患者的差异无统计学意义（LSDt健康体检者vs.Ⅰ、Ⅱ期=1.546，P健康体检者vs.Ⅰ、Ⅱ期＞0.05）。Spearman相关分析显示，血清HOTAIR表达与临床分期之间呈正相关（r=0.625，P=0.003）。见图2。

图2 血清HOTAIR在健康体检者与不同临床分期患者的表达

2.3 淋巴结转移情况与血清HOTAIR表达的相关性

淋巴结转移患者血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值为（52.89±9.67），高于无淋巴结转移患者的（28.69±6.44）与健康体检者的（17.63±5.75），无淋巴结转移患者的血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值高于健康体检者，差异均有统计学意义（F =234.928，P ＜0.001；LSD-t淋巴结转移vs.非淋巴结转移= 12.722，P淋巴结转移vs.非淋巴结转移＜0.001；LSD-t淋巴结转移vs.健康体检者=21.667，P淋巴结转移vs.健康体检者＜0.001；LSD-t非淋巴结转移vs.健康体检者=6.636，P非淋巴结转移vs健康体检者＜0.001）。Spearman 相关分析显示，血清HOTAIR表达与淋巴结转移之间呈正相关性（r=0.772，P ＜0.001）。见图3。

图3 血清HOTAIR在健康体检者与淋巴结转移及非转移患者的表达

2.4 血清HOTAIR 表达对结肠癌诊断与转移的评估价值

血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值诊断结肠癌的临界值为（20.50±3.98），诊断敏感度0.818，特异度0.794。血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值判断淋巴结转移的临界值为（32.46±5.85），诊断敏感度0.750，特异度0.889。见图4、图5。

图4 血清HOTAIR诊断结肠癌的ROC曲线

图5 血清HOTAIR判断结肠癌淋巴结转移的ROC曲线

3 讨论

HOTAIR位于哺乳动物细胞染色体，是第1个被发现具有反式转录调控作用的长链非编码RNA。HOTAIR的作用及分子机制虽然尚未完全明确，但其在恶性肿瘤中发挥的作用已引起临床重视。

有研究表明［8］，HOTAIR是表观转录调控的结肠癌相关长链非编码RNA，癌组织的HOTAIR 表达情况或与结肠癌浸润深度、血管侵犯、转移、复发等有关。本研究将结肠癌患者癌组织与癌旁正常组织的HOTAIR表达量进行对比，结果发现癌组织中HOTAIR 的mRNA 相对表达值为（25.41±6.10），高于癌旁正常组织的（6.37±1.59），差异有统计学意义（P ＜0.05），提示癌组织中HOTAIR 表达可能与肿瘤行为有关。但朱州等［9］的研究结果显示，结肠癌癌组织与癌旁正常组织的HOTAIR 表达差异并无统计学意义，笔者考虑其与本文结果不同的原因可能是与所采用的扩增引物不同有关。HOTAIR 主要通过DNA 甲基化、蛋白修饰、染色质重构等途径抑制多种抑癌基因表达，从而促使肿瘤发生、侵袭与转移［10］。尹磊等［11］的研究发现，HOTAIR 表达下调可减弱肿瘤细胞的侵袭转移能力。且有研究发现［12］，HOTAIR 下调后肿瘤对化疗药物的敏感性随之提高，可为肿瘤个体化治疗提供新的靶点。钱力等［13］的研究发现，在肝癌细胞系中敲除HOTAIR 基因后，人基质金属蛋白酶-9 与血管内皮生长因子表达大幅下调，HOTAIR基因可能通过对上述两种蛋白的调节来增强肿瘤细胞的增殖。提示HOTAIR 异常表达与肿瘤的发生发展有关，与本文的结果相一致。

本研究对结肠癌患者血清中HOTAIR 表达进行分析，发现Ⅲ、Ⅳ期结肠癌患者血清HOTAIR 的mRNA 相对表达值高于Ⅰ、Ⅱ期结肠癌患者与健康体检者，尤其Ⅲ、Ⅳ期结肠癌患者的血清HOTAIR异常高表达，且血清HOTAIR 表达与临床分期呈正相关，临床分期越高，血清HOTAIR 表达越高，这与HOTAIR 参与细胞凋亡调控、细胞生长与侵袭调控等过程有关［14］。通过绘制血清HOTAIR 的mRNA相对表达值诊断结肠癌的ROC 曲线发现，临界值为（20.50±3.98）时诊断敏感度为0.818，特异度0.794，表明血清HOTAIR 表达对于结肠癌具有良好诊断价值。刘浩等［15］发现，HOTAIR 在肿瘤原发灶及转移灶中的表达高均于正常对照组，且转移灶中HOTAIR表达更高，提示HOTAIR 与肿瘤转移存在相关性。靖琳等［16］的研究认为，HOTAIR 是通过上皮间质途径促进结肠癌细胞转移。本研究中，不论是有淋巴结转移患者还是无淋巴结转移患者，血清HOTAIR的mRNA 相对表达值均较健康体检者呈高表达，血清HOTAIR 表达与淋巴结转移之间正相关，提示血清HOTAIR 表达对结肠癌转移有一定的预测价值，当HOTAIR 的mRNA 相对表达值高于（32.46±5.85）时，其判断淋巴结转移的敏感度0.750，特异度0.889，提示其预测价值较好。值得注意的是，长链非编码RNA 长度较长，在外周血中可能会断裂成小段而出现扩增不成功的情况，故检测血清中HOTAIR表达时应注意引物序列的选择，可针对不同片段设计不同引物。

综上所述，结肠癌患者血清及组织内HOTAIR均异常表达，癌组织HOTAIR 表达高于癌旁正常组织，而结肠癌患者血清HOTAIR 表达也高于正常人群，且与临床分期、淋巴结转移有关，可作为结肠癌诊断及转移的评估参考指标。