不同产地芡实的品质特性评价

张 丽,曾嘉程,王 梦,付 晓,陈继光,上官新晨,3,尹忠平,*

(1.江西农业大学食品科学与工程学院,江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045;2.江西明湖农业发展有限公司,江西上饶 335100;3.江西省食品药品监督管理局,江西南昌 330045)

芡实(EuryaleFeroxSalisb.),睡莲科(Nymphaeaceae.)芡属,是一年生水生植物干燥成熟的种仁,始载于《神农本草经》,被历版中国药典所收载[1]。芡实又名鸡头果、鸡头莲、鸡头苞等[2],有“水中人参”的美誉,是珍贵的药食两用材料。在国外主要分布于印度、韩国、日本、东南亚、俄罗斯;在国内主要种植于江苏、山东、湖南、湖北、安徽、江西等省,有“刺芡”(北芡)与“苏芡”(南芡)之分。芡实味甘、涩,性平,常用于养血安神、益肾固精、健脾、除湿、止带、遗尿尿频[3-4],是重要的经济作物,在传统医学中已有数百年的历史[5]。

芡实含有丰富的营养成分,在印度等国家,芡实是当地的主要作物[6-8];芡实主要含碳水化合物和蛋白质[9],根据张氽等[10]的检测结果,安徽产芡实中的淀粉含量为72.27%,粗蛋白为9.72%;除此之外,还具有多种功效成分,包括黄酮类、环肽类、甾醇类、脂类、脑苷脂类等[11-12]。土壤、气候、温度、光照等环境的不同,而导致药材品质上的差异[6],品种和产地的不同可导致芡实的营养成分和活性成分上的较大差异[13-15]。因产地气候和环境上的不同,加上品种上的差异,芡实外观质量、经济性状和营养成分等指标存在差异,一般的鉴别方法难以分辨其品质的优劣。目前,有文献研究了不同产地芡实中无机元素的含量、建立芡实的HPLC指纹图谱来评价不同产地芡实的质量品质[16-17];芡实作为一种富含营养的药食两用的材料,用于药膳保健及产品开发的原料,至今尚无系统、明确的指标和方法来综合评价芡实的品质。本文对芡实的外观、营养成分、活性成分进行了系统、全面的检测,采用主成分分析(PCA)和聚类判别方法(CA)来对不同产地芡实进行模式识别研究,为芡实品质的科学评价和芡实资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

13个样品分别产于江苏、安徽、江西等6省13地市的芡实栽培区或种植基地(2016年10月中旬采收),样品信息如表1所示；乙腈 色谱纯,美国Tieda试剂有限公司;乙醇、冰乙酸,冰乙酸 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;硝酸 优级纯,南京化学试剂有限公司;Mn单元素标准溶液(10 μg/mL)、混合标准品溶液(含K、Fe、Al、Mg、Ca、P、Zn) 1000 μg/mL,国家有色金属及电子材料分析测试中心。

表1 13个芡实样品的来源和编号

Agilent1260型高效液相色谱仪 美国Agilent科技有限公司;ETHOS型微波消解系统 意大利MILESTONE公司;Agilent 5100 VDV ICP-OES 美国Agilent科技有限公司;色差仪ColorQuest XE 美国HunterLab;超纯水制备仪 美国Millipore公司;中草药粉碎机 永康市艾泽拉电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芡实外观质量和特性的描述和检测 参考王中奎等[18]的方法,略作修改,分别描述带壳芡实形状、壳面光滑程度、核仁饱满情况;用游标卡尺测量带壳芡实的纵径、横径、果壳厚度,描述果壳的特性,计算坚果的果形指数(果实纵径与横径的比值);测定带壳芡实的百果质量和去壳百种仁质量,计算果仁出仁率(去壳核仁质量占果实总质量的百分率);以色差仪测定芡实外壳颜色的L*、a*、b*值,L*代表亮度,范围在0～100之间,L*值越高表明样品表面越白;a*代表红度,b*代表黄度。

1.2.2 样品预处理 采用专用的鹰嘴钳,将来自于江苏、安徽、江西等13个芡实栽培区或种植基地的带壳芡实进行手工去壳,得到芡实壳和芡实种仁;用粉碎机将13个芡实种仁样本进行粉碎,过80目筛,即得到芡实粉末,分别装入自封袋中备用,以用来测定下述指标。

1.2.3 芡实主要营养成分的测定 水分含量的测定:直接干燥法,按照GB 5009.3-2016执行;灰分含量的测定:按照GB 5009.4-2016执行;脂肪含量的测定:索氏抽提法,按照GB 5009.6-2016执行;膳食纤维含量的测定:按照GB 5009.88-2014执行;粗蛋白含量测定:半微量凯氏定氮法,按照GB 5009.5-2016执行;淀粉含量的测定:酸水解法,按照GB 5009.9-2016执行。

1.2.4 芡实醇提物的HPLC测定方法 参照陈蓉等[16]的方法,略作修改。样品制备:称取5 g芡实粉末,加入50 mL 80%乙醇超声提取30 min,4000 r/min离心5 min后取上清液浓缩,用2 mL 80%乙醇溶解后经0.45 μm滤膜过滤后备用。

色谱柱为Agilent Eclipse C18色谱柱(4.6 mm×250 mm;5 μm);流动相为乙腈(A)及1%醋酸水溶液(B)进行梯度洗脱;流速为1 mL/min;进样量为10 μL;检测波长:273 nm;柱温30 ℃,洗脱程序:流动相:乙腈(A)及1%醋酸水溶液(B);梯度洗脱:0～5 min,98% B,5～10 min,98%～92% B,10～12 min,92%～90% B,12～32 min,90%～87% B,32～50 min,87%～60% B,50～60 min,60%～30% B,60～65 min,30%～98% B。

1.2.5 芡实金属元素含量的测定 参考王红等[17]的方法,主要检测步骤如下:分别精密移取混合标准溶液(含K、Fe、Al、Mg、Ca、P、Zn)0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mL,用5%的浓硝酸定容至50 mL,配成质量浓度分别为0、2、5、10、15、20、25 mg/L系列的混合对照品溶液;分别精密移取Mn标准溶液0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mL,用5%的浓硝酸定容至50 mL,配成含质量浓度分别为0、2、5、10、20、25、100、200 μg/L系列混合对照品溶液。

精密称取芡实粉末0.2～1 g样品放入聚四氟乙烯消解罐中,精确加入5 mL浓硝酸,置于通风橱中静置20 min,待反应不剧烈后加盖密封,装入微波消解仪中,从25 ℃升至220 ℃,维持220 ℃消解20 min后,冷却至室温,取出,在通风橱中挥尽余酸,转移至50 mL容量瓶中,用去离子水定容至刻度线,摇匀,即得待测样液。除未加样品,其他步骤相同,作为空白对照。

ICP-OES工作条件:等离子体射频功率1.20 kW,等离子气流量12 L/min,雾化器流量0.70 L/min,辅助气流量1.0 L/min;泵速12 r/min,读取时间5 s,稳定时间15 s,观察方向径向,观察高度8 mm。

1.3 数据处理

本研究使用的统计分析软件为R-3.3.1。使用LSD.test()函数进行组间差异分析;先使用scale()函数对数据进行标准化处理,再采用principal()函数、hclust()函数分别进行主成分和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地芡实的外观特征

图1a是来自于江苏、安徽、江西等6个省13个芡实栽培区或种植基地的带壳芡实,图1b和图1c是手工去壳后分别得到的芡实壳和芡实种仁。从图1可以直观的看出,不同产地的芡实在颗粒大小、形状、色泽和果壳厚度等存在差异,B(安徽省合肥市)产地苏芡颗粒较大,产地L(江西省上饶市)较小;壳的厚度和种仁的大小基本上与带壳颗粒的大小成正比,大颗粒的芡实一般来说壳较厚、种仁较大;种仁粒径的差异没有带壳颗粒粒径的差异那么大。由表2可知,不同产地芡实在果形、外壳光滑度、取仁难易度、种仁饱满度方面也存在较大的差异;外形上有椭圆或长圆形两种形状,苏芡表面较刺芡表面光滑;从外观色泽上来看,不同产地芡实的颜色差异很大,L*值介于52.65～30.03 之间,产地D(江苏省扬州市)的芡实的亮度最大,产地F的芡实的亮度最低;a*值范围为13.75～1.51,均为正值,产地D的芡实的a*(13.75)显著高于其他各产地;不同产地芡实的b*值均为正,其中D产地的芡实b*值最大(25.99),L产地的芡实的b*值(3.81)最小。总的来说,苏芡颗粒较大,外种皮厚,表面光滑,棕黄色或棕褐色,种仁圆整;刺芡颗粒近圆形,较小[19]。

图1 来源于13个产地的芡实全果、果壳和种仁照片

表2 来源于13个产地的芡实的外观形态特征

芡实的经济价值取决于其外形、果壳厚度、种仁大小和出仁率等。由表3可知,不同产地的芡实经济价值指标差异较大。从果形指数来看,苏芡在外形上偏圆,刺芡偏椭圆和长圆,其中江苏省苏州市产地(编号C)的苏芡的芡实果形指数最小(0.90),果形偏圆,外形圆润、美观,与其相近的是产地A、D和B的芡实,平均果形指数分别为0.91、0.92和0.93;而产地L的芡实平均果形指数最大(1.11),果形呈长圆形,外形较差。芡实百果质量、果仁质量、出仁率是主要经济性状指标,直接关系到芡实的经济价值。由表3中可看出,不同产地芡实的百粒质量的差别较大,其中B产地的芡实在百果质量(128.55 g)和百果仁质量(60.51 g)两方面都显著高于其他产地(p<0.05),分别是L产地芡实百果质量(36.66 g)的3.51倍和百果仁质量(24.35 g)的2.49倍。果壳厚度指标能衡量取仁的难易程度,也影响出仁率,苏芡(产地A、B、C、D)的果壳都显著(p<0.5)厚于刺芡,其果壳厚、多孔、不紧实;而刺芡则与之相反,易于去壳,如B产地芡实的果壳厚度(3.58 mm)达到M产地芡实的(0.98 mm)3.65倍,这也导致了苏芡的出仁率低于刺芡,如产地M芡实的出仁率(68.80%)最高,产地C芡实的出仁率(44.71%)最低。

表3 不同产地芡实的经济性状指标比较

2.2 不同产地芡实种仁的主要成分

营养成分含量是芡实品质的重要指标,从表4中可看出,不同产地芡实营养成分指标有明显差异。芡实中含有最多的营养成分是碳水化合物,13份样品中以D产地芡实的淀粉含量百分比最大,为76.84%,其次是产地L的芡实(76.53%),产地F的芡实淀粉含量最低,为69.68%,与最大值相差7.16%。芡实营养成分中居第二位的是蛋白质,由表4可看出,产地A的芡实蛋白质含量最大,为13.61%,与产地M、E、F、H、J的差异不明显;蛋白质含量最低的是D产地的芡实,仅为11.03%。膳食纤维含量最大的是产于F(4.24%)产地的芡实,其显著(p<0.05)高于其他产地的芡实,是含量最低L产地芡实的1.61倍(2.64%)。芡实中含有少量的脂肪,多为不饱和的脂肪酸[11-12]。从表4中可看出,K产地芡实的脂肪含量百分比最大,为0.66%,显著高于其他产地,是产地G芡实的2.75倍(G产地的芡实脂肪含量仅为0.24%)。

表4 不同产地芡实主要营养成分的含量(%)

2.3 不同产地芡实醇提物的HPLC检测与分析

不同的生长环境、土壤性质等会导致药材具有不同含量的功效成分,从而导致不同的药效,通常可采用液相来测定这些功效成分,据此评价药材的品质[20]。本文中采用高效液相色谱(HPLC)法,检测了13个不同产地芡实样品乙醇提取物中的主要成分,据此建立了芡实的指纹图谱(图2b)。从HPLC检测谱图(图2a)可知,13批芡实样品有12个共有峰,峰2、3、8是芡实乙醇提取物中最主要的组分。

图2 芡实样品的HPLC检测图谱(a)和其余13批芡实样品的HPLC检测叠加图谱(b);

采用国家药典委员会颁发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A》对不同产地芡实进行质量评价。由指纹图谱的结果可知,保留时间的RSD均小于0.68%,表明方法稳定可靠,符合指纹图谱技术要求;但峰面积的RSD(23.69%～102.55%)变化较大;产地A～M的特征图谱的相似度值分别为0.92、0.94、0.94、0.95、0.90、0.93、0.93、0.84、0.90、0.96、0.96、0.93、0.96、0.90,说明化学组成较一致。

结合表5可知,其中产地D(江苏省扬州市)苏芡的总峰面积(13316.05)最大,是产地L刺芡的总峰面积(5592.61)的2.38倍;其中主要的组分是峰2、3、8,产地D的峰2的面积(3629.46)最大,产地A的峰2的面积(871.98)最小;产地I的峰3的面积(2257.01)最大,产地L的峰3的面积(990.42)最小;产地H的峰8的面积(2871.44)最大,产地L的峰8的面积(341.03)最小。不同产地的芡实在各峰的峰面积上存在不同程度的差异,但大部分样品的谱图总体上相似,共性特征基本相同,说明不同产地芡实的成分组成基本上是一致的,但在成分含量上存在差异,其原因可能与产地气候、水土、加工方法等因素有关。但本文所选出的共有成分未知,需要结合质谱等手段进一步确定。

表5 不同产地芡实样品的HPLC检测结果

2.4 不同产地芡实无机元素含量的测定结果与分析

不同产地的地理、气候、土壤等因素会影响植物的无机成分含量[21],无机元素与蛋白质、肽、脂类、多糖、核酸等生物分子密切相关,并调控生理功能的关键步骤,从而影响中药材的药效和品质[22-23]。本文采用ICP-OES法对不同产地芡实的无机元素(Mn、K、Fe、Na、Mg、Ca、P、Zn)进行了系统地测定,标准曲线方程如表6，结果如表7所示。由表7可知,芡实中含较丰富的大量元素(Na、Mg、P、K和Ca),其中含量最高的是元素P,可高达1590.67 μg/g,微量元素Mn、Fe和Zn的含量也较为丰富,含量最高可分别达到25.53、17.84和38.39 μg/g。从本文测定的元素来看,产地E(安徽省天长市)的刺芡中元素K(1458.90 μg/g)、Mg(348.95 μg/g)、P(1590.67 μg/g)、Zn(38.39 μg/g)的含量均高于其他产地,但元素Ca(90.79 μg/g)、Mn(15.99 μg/g)的含量低于其他产地。

表6 标准曲线方程

表7 不同产地芡实中的无机元素检测结果

2.5 主成分分析

主成分分析法是将多个变量通过线性变换,降维,选出较少个数的代表性变量进行综合分析和评价的方法[24]。本文通过主成分分析分法将23个指标降维成6个主成分,得到芡实主成分因子负荷矩阵(见表8),前6个主成分累积方差贡献率达到91.20%,尽可能反映了原变量的信息。其中,对PC1(第1主成分)影响的主要指标为a*、b*、果形指数、百果质量、果壳厚度、出仁率、脂肪、Na、P、Zn;对PC2(第2主成分)影响的主要指标为L*、百果仁质量、总峰面积、Mn、Ca、K;对PC3(第3主成分)影响的主要指标为水分、蛋白质、淀粉;对PC4(第4主成分)影响的主要指标为灰分、Fe;对PC5(第5主成分)影响的主要指标为Mg;对PC6(第6主成分)的影响主要指标为膳食纤维。

表8 主成分因子载荷矩阵

依据相关矩阵累计方差贡献率提取的6个主成分为综合评价指标,得到了不同产地芡实的综合评分(F)及得分排名(见表9)。苏芡的综合排名靠前,刺芡的排名靠后,就本实验测定的23个指标和本文的计算方式而言,苏芡和刺芡的不论从外观还是组分含量上与刺芡存在明显差异。这与吴仰风[19]的研究结果相同,苏芡(南芡)植株个体较大,种仁圆整,糯性,煮食不易碎裂,品质优良;刺芡(北芡)植株个体和器官均较小,种子和种仁近圆形,较小,欠整齐,粳性,品质中等。

表9 不同产地芡实的主成分得分及综合排序

2.6 不同产地芡实的聚类分析

以系统聚类分析对不同产地芡实的各项指标进行系统聚类,据此来研究13个芡实样品的关系,结果如图3。从聚类树形图可以看出,可将2个品种13个不同产地的芡实分为两类:第Ⅰ类聚集产地A(江苏省淮安市洪泽区)、B(安徽省合肥市庐江县)、C(江苏省苏州市)、D(江苏省扬州市宝应县)的芡实;第Ⅱ类聚集了其他产地的刺芡,与主成分分析的结果基本类似,这两种分析方法可以相互验证。本文前述数据也显示,苏芡个体较大,种仁圆整,在果形指数、果质量、果壳厚度方面与其他产地的刺芡存在显著差异(p<0.05)。随着阈值的减小,第Ⅱ类又可分为2小类,相同产地的样品多被聚在一个小类之中;产地L和E的刺芡聚为一小类,这两个产地的刺芡成分较为相近,在果壳厚度、百果仁质量、出仁率和脂肪、膳食纤维的含量相近,在p<0.05水平上无显著差异,这也从另一角度说明了本文聚类结果的合理性和可靠性。来自江苏省、广东省、山东省、江西省、河南省5个产地的刺芡聚为另一小类群。产地对芡实果实的品质有一定的影响,但相比品种而言,影响相对较小,在采摘时应尽量按品种分批采收,不同产地相同品种采后尽量不混放,避免加工原料不统一。

图3 不同产地芡实聚类分析图

3 结论

本文从外观、主要营养成分、活性成分、微量元素四个方面对产自于江苏、安徽、江西等13个不同栽培区或种植基地的芡实品质进行了综合评价,发现不同产地的芡实在外观上差异明显,苏芡个体较大,种仁圆整,壳厚,出仁率低;刺芡个体较小,种仁近圆形,壳薄,出仁率高。不同产地的芡实在淀粉、粗蛋白、脂肪、微量元素等主要成分含量上的差异也非常显著(p<0.05)。高效液相色谱共有图谱分析显示样品间的相似度为0.84,说明化学组成较一致,但在成分含量上存在差异。这些指标表明各个产地芡实各具特色,各有所长,单一或几个指标难以表征芡实的真实品质。通过主成分分析,可将23个评价指标综合为6个主成分,6个主成分反映了原变量91.20%的信息,可为芡实品质评价提供参考。通过聚类分析,可将13个产地的芡实聚为苏芡和刺芡两大类,表明芡实品质受品种影响较大,产地对芡实的品质有一定的影响,但相比品种而言,影响相对较小。