结直肠癌组织中MMR蛋白表达缺失的影响因素分析

郭源 张龙 张舜 余彦平 吕勇志 李纪鹏

结直肠癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其发生、发展过程复杂，涉及多个基因的参与[1]。错配修复（MMR）基因突变导致的MMR缺陷是结直肠癌发生、发展的重要机制[2-3]。研究表明，MMR蛋白表达与肿瘤病理及患者预后相关[4-5]。2017版美国国家综合癌症网络指南建议，对所有结直肠癌患者进行微卫星不稳定（MSI）/MMR检测[6]。目前研究发现与人类有关的MMR有9种，其中与结直肠癌发生、发展相关的MMR有4种，即MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2[7]。本文对结直肠癌组织中MMR表达情况及影响MMR表达缺失的因素进行分析，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2008年1月至2017年12月在中国人民解放军空军军医大学第一附属医院接受结直肠癌根治术的1 560例结直肠癌患者为研究对象，其中男913 例，女 647 例；年龄 12～92（59.55±13.52）岁。纳入标准：（1）临床病理资料完整；（2）术前未接受过放化疗或其他治疗；（3）无其他肿瘤。所有患者签署知情同意书。

1.2 免疫组化染色 使用全自动免疫组化染色仪（BOND-MAX，美国Leica公司）；检测试剂主要有MLH1单克隆鼠抗人抗体工作液克隆号ES05、MSH2单克隆鼠抗人抗体工作液克隆号MX061、MSH6单克隆鼠抗人抗体工作液克隆号MX056、PMS2单克隆鼠抗人抗体工作液克隆号MOR4G，均购自福州迈新生物技术开发公司。取术中切除的结直肠癌组织样本，10%甲醛溶液固定，常规连续切片，厚度4μm，脱蜡至水。PBS冲洗，依地酸钠钙（EDTA）高压热修复2min，室温下自然冷却20min，流水冲洗干净。PBS冲洗5min×3次，置于3%双氧水浸泡10min，蒸馏水冲洗干净。PBS冲洗5min×3次，滴加一抗，连孵育盒放入37℃暖箱孵育1h。PBS冲洗5min×3次，滴加二抗，连孵育盒放入37℃暖箱孵育30min。PBS冲洗5min×3次，DAB显色剂显色，PBS终止显色，流水冲洗1min。苏木素进行复染，盐酸乙醇用于分化，乙醇及二甲苯分别用于脱水、透明，封片，镜检。阳性细胞判断标准：细胞核呈棕黄色，细胞膜、细胞间质均不着色。

1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件。计数资料用率表示，影响直肠癌组织中MMR表达缺失的单因素分析采用χ2检验或Mann-Whitney U检验，多因素分析采用logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中MMR表达情况 1 560例结直肠癌组织中MMR表达缺失315例（20.2%）。其中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 单独缺失分别 3、8、17、106例；MLH1 联合 PMS2、MSH2 联合 PMS2、MSH2 联合MSH6、MSH6联合 PMS2缺失分别 97例、1例、67例、8例；MSH2、MSH6、PMS2 共同缺失 4 例，MLH1、MSH6、PMS2 共同缺失 3 例；MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 共同缺失1例。

2.2 影响结直肠癌组织中MMR表达缺失的单因素分析 结直肠癌组织中MMR表达缺失与患者性别、肿瘤部位、肿瘤类型、T分期均无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与患者年龄、肿瘤直径、分化程度、N分期、M分期、TNM分期均有关，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

表1 影响结直肠癌组织中MMR表达缺失的单因素分析[例（%）]

2.3 影响结直肠癌组织中MMR表达缺失的多因素分析 以MMR表达缺失为应变量，以单因素分析结果P＜0.05的因素为自变量进行logistic回归分析，结果显示肿瘤直径、分化程度（低分化）是结直肠癌组织中MMR表达缺失的独立影响因素，见表2。

表2 影响结直肠癌组织中MMR表达缺失的多因素分析

3 讨论

在世界范围内，结直肠癌发病率居所有恶性肿瘤的第3位，其病死率居所有恶性肿瘤的第4位，严重威胁着人类健康[8]。导致结直肠癌的外在不良因素主要有高脂、低纤维饮食等[9]。同时，其内在因素也不能忽视。继1993年首次发现MMR基因以来，越来越多学者探索其与结直肠癌发生、发展的内在联系。在正常机体内，存在着一套完整的修复系统，对维护基因的稳定性和完整性起着重要作用，如MMR系统等[10]。MMR系统能特异性地发现并矫正DNA碱基的错配，避免基因发生突变，防止肿瘤的发生[11-12]。当MMR基因受到外界因素（如生物因素、温度变化等）的干扰会发生突变，不能识别DNA复制过程中出现的碱基错配，从而导致MSI的发生[13]。

目前对MMR基因的检测方法主要有DNA测序法、免疫组化法。DNA测序法采用美国国立癌症研究所推荐的一组微卫星标记点，即BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；当2个及以上分子标记显示异常为高频MSI，仅1个显示异常为低频MSI，无异常为微卫星稳定[14]。免疫组化法则是通过检测MMR蛋白表达进行筛查。相比于DNA测序法，免疫组化法操作方便、价格实惠，被广泛用于临床[15]。

相关研究表明，MMR缺陷会影响肿瘤的生物学特征，如好发于右半结肠、倾向于低分化和黏液腺癌、较低的淋巴结转移率及远处转移率[16-18]。同时检测MMR蛋白表达，有利于为结直肠癌患者术后诊疗方案的制定及预后判断提供参考[19-21]。有文献报道，MMR正常的结直肠癌患者对程序性死亡受体单抗治疗无效[22]。本研究结果发现，结直肠癌组织中MMR蛋白表达缺失率为20.2%，肿瘤直径、分化程度是结直肠癌组织中MMR表达缺失的独立影响因素。可见，部分结直肠癌患者中可出现MMR缺陷，且与肿瘤直径、分化程度等存在一定的关系。检测结直肠癌组织中MMR蛋白表达，有助于术后诊疗方案的制定与预后判断，提高结直肠癌的诊疗水平。