大丁草2种提取物对二甲苯所致耳肿胀炎症模型小鼠的抗炎作用※

高长久 张朝立* 李 洁 李文超 吴兆华

（1 牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011；2 牡丹江医学院附属红旗医院血液科，黑龙江 牡丹江 157011）

大丁草（Herb of Common Leibnitzia），又名烧金草、豹子药、苦马菜、米汤菜、鸡毛蒿、白小米菜、踏地香、龙根草、翻白叶、小火草、臁草等，始载于《本草纲目》，为菊科大丁草属多年生草本植物大丁草Leibnitzia anandria（L.）Nakai［Gerbera anandria（L.）Sch Bip.］的全草，其味苦，性寒，具有清热解毒，消肿止痛等功效，主治湿热泻痢、热淋、风湿关节痛、痈疖肿毒、臁疮、虫蛇咬伤、烧烫伤、外伤出血等病证［1］。本项目分别采用水和乙醇（75%）2种溶剂对大丁草药材进行提取，通过二甲苯耳肿胀法、腹腔通透性法对其水提物与醇取物的抗炎作用进行评价，通过统计学方法分析确定大丁草的抗炎有效部位，为其临床合理用药提供理论依据，为拓展其临床应用范围奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康昆明种（SPF）级小鼠，体质量为18～22 g，雌雄兼用。由牡丹江医学院实验动物中心提供。实验前在本实验室适应性饲养3 d，室温19～25℃，相对湿度45%～68%。

1.2 实验药品与试剂 大丁草采自黑龙江牡丹峰国家级自然保护区，经黑龙江中医药大学药学院中药资源与开发教研室王振月教授鉴定为菊科植物大丁草Leibnitzia anandria（L.）Nakai［Tussi-lago anandria L.；Gerbera anandria（L.）Sch.-Bip］；吲哚美辛肠溶片，批号171025，山西云鹏制药有限公司提供；二甲苯，批号：171108，国药集团化学试剂有限公司提供；伊文思蓝，批号171019，上海懋康生物科技有限公司提供；75%乙醇，批号20170925，上海时代生物科技有限公司提供。

1.3 实验仪器 分析天平，型号AUX220，岛津企业管理（中国）有限公司提供；电子天平，型号YP-6002，上海精密仪器仪表有限公司提供；旋转蒸发仪，型号RE-2010，上海濮安生物科技有限公司；离心机，型号TDL-5A，江苏省金坛市宏华仪器厂提供；紫外-可见分光光度计，型号Cintra1010，北京东西分析仪器有限公司提供；电热套（加热套），型号EM2000/CE，北京诺植科技有限公司提供；循环水真空泵，型号SHB-111A，西安莫吉娜仪器制造有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 大丁草2种提取物的制备

1.4.1.1 大丁草水提物的制备 将大丁草药材剪成5～8 mm放入烧杯中，加入纯净水浸泡60 min后，先大火煮沸，小火持续沸腾25 min后，用纱布过滤后得滤液，其滤渣再加5倍水量煎煮2次后弃去，将3次煎煮所得滤液混合，放入离心机中离心，所得上清液浓缩，即为水提物，调节pH值（7.2），灭菌后放入冰箱（3～5℃） 保存备用。经检测主要成分为香豆素类和黄酮类等，其中大丁苷、大丁纤维二糖苷、大丁龙胆二糖苷的含量分别为0.235%、0.089%和0.011 2%。

1.4.1.2 大丁草醇提物的制备 将大丁草药材粉碎过筛，其粉末加乙醇（75%）浸泡60 min后，设置加热套70℃下回流提取3次，静置，用真空泵抽滤，合并3次滤液，置于旋转蒸发仪旋蒸回收乙醇后，即为醇提物，调节pH值（7.2），灭菌后冰箱（3～5℃）保存备用。经检测主要成分为香豆素类和黄酮类等，其中大丁苷、大丁纤维二糖苷、大丁龙胆二糖苷的含量分别为0.226%、0.074%和0.009 3%。

1.4.2 剂量设计 大丁草给药剂量参考《中华本草》成人每日用量，按动物与人体的每千克体质量等效剂量折算系数换算成小鼠的剂量，水和醇2种提取物的给药剂量按提取量相当于生药量的比例进行换算。通过预实验，确定大丁草水和醇2种提取物抗炎实验的最低有效剂量均为3.2 g/kg，并设定大丁草水和醇2种提取物高剂量组给药剂量均为6.4 g/kg。

1.4.3 小鼠耳肿胀实验 取72只雌雄各半小鼠，随机分成6组：大丁草水提物高、低剂量组，大丁草醇提物高、低剂量组，生理盐水组（20 mL/kg），吲哚美辛组（9.4 mg/kg），每组12只小鼠。大丁草水提物和醇提物高、低剂量组的给药剂量分别为6.4，3.2 g/kg（生药/体质量）。每天按照0.2 mL/10 g，灌胃给药，1次/d，连续7 d。于末次给药1 h后，将0.05 mL二甲苯均匀涂抹于各组小鼠右耳的两面致炎，小鼠的左耳不涂作为对照，30 min后脱颈椎处死，沿着小鼠耳廓剪下小鼠的两耳，用直径6 mm的打孔器在左右耳相同位置冲下圆形耳片，分别称重，以两耳片的质量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制率［2-5］。肿胀度=右耳重（肿胀耳）-左耳重（对照耳）。肿胀抑制率（%）=（对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/对照组平均肿胀度×100%。

1.4.4 小鼠腹腔通透性实验 分组及给药方法同“1.4.3”项，于末次给药后1 h，经小鼠尾静脉注射0.25%伊文思蓝（10 mL/kg），腹腔注射 0.6% 醋酸 （10 mL/kg），15 min后将小鼠处死，腹腔注入0.9%氯化钠溶液（生理盐水）6 mL冲洗，腹腔洗出液2000 r/min离心10 min（r=8 cm），取上清液用紫外-可见分光光度计于590 nm波长处测定吸光度（A） 值［6-10］。

2 结果

2.1 对小鼠一般特征的影响 各实验组小鼠生活状态与实验前均无明显差别，无精神萎靡或死亡，饮食量与饮水量基本稳定，各组体质量增长速度无明显差异。

2.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 与生理盐水组比较，大丁草水和醇提物高、低剂量组（生药6.4、3.2 g/kg）及吲哚美辛组（9.4×10-3g/kg） 小鼠耳廓肿胀度均被抑制，有随着药物浓度的增高而肿胀度降低的趋势，其中大丁草水和醇高剂量组、吲哚美辛组差异有极显著意义（P＜0.01），低剂量组差异有显著意义（P＜0.05）。提示大丁草水和醇提物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀有抑制作用，水提物的抑制效果略强于醇提物。见表1。

表1 大丁草2种提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 （）

表1 大丁草2种提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 （）

注：与生理盐水组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

组别 鼠数生理盐水组吲哚美辛组水提物高剂量组水提物低剂量组醇提物高剂量组醇提物低剂量组13.7±1.5 7.1±1.4**9.2±1.2**10.9±1.0*9.5±1.3**11.0±1.7*12 12 12 12 12 12剂量（g/kg） 肿胀度（mg）20.0 9.4×10-3 6.4 3.2 6.4 3.2抑制率（%）-55.5 32.8 20.4 30.7 19.7

2.3 对小鼠腹腔通透性的影响 与生理盐水组比较，大丁草水和醇提物高、低剂量组（生药6.4、3.2 g/kg）及吲哚美辛组（9.4×10-3g/kg）腹腔冲洗液A值明显减小，有随着药物浓度的增高而使腹腔通透性降低的趋势，其中高剂量组差异有显著意义（P＜0.05），低剂量组差异无显著意义（P＞0.05）。提示大丁草水和醇提物对0.6% 醋酸致小鼠腹腔通透性增加有抑制作用，水提物与醇提物的抑制效果无差异。见表2。

表2 大丁草2种提取物对小鼠腹腔通透性的影响 （）

表2 大丁草2种提取物对小鼠腹腔通透性的影响 （）

注：与生理盐水组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

0.15±0.04 0.08±0.02**0.10±0.03*0.13±0.07 0.10±0.02*0.13±0.03组别 鼠数生理盐水组吲哚美辛组水提物高剂量组水提物低剂量组醇提物高剂量组醇提物低剂量组12 12 12 12 12 12剂量（g/kg） A值20.0 9.4×10-3 6.4 3.2 6.4 3.2

3 讨论

中草药大丁草原植物在我国南北各地均有分布，生于山坡路旁、林边、草地、沟边等阴湿处，蕴藏量巨大，为大丁草在中医药领域的研发与应用提供了深厚的资源基础。大丁草具有清热解毒、消肿止痛等功效，推测其具有抗炎方面的相关药理作用，并尚未发现相关报道，且毒性较低［11-12］，有着较好的药用开发与利用价值。故本项目采用水和75%乙醇2种溶剂分别对大丁草进行提取，所得水提物和醇提物通过二甲苯致小鼠耳肿胀实验、小鼠腹腔通透性实验对其抗炎效果进行评价。

小鼠耳肿胀实验结果提示大丁草水和醇2种提取物高、低剂量组（生药6.4、3.2 g/kg）均可抑制由二甲苯致炎剂引起的某些炎症介质（如组胺、激肽、纤维蛋白溶解酶等）的释放，降低局部毛细血管扩张和通透性增加及炎症细胞浸润，从而减轻耳部急性渗出性炎性水肿；小鼠腹腔渗透实验提示大丁草2种提取物高、低剂量均可降低因腹腔注射冰醋酸溶液中H+作用下引起的腹腔毛细血管通透性增高，减少血液液体成分（如伊文思蓝与血浆蛋白结合物等）从血管内向腹腔渗出，从而对急性炎症产生抑制作用。

本项目从药效学角度研究表明，大丁草水和醇2种提物高、低剂量组（生药6.4、3.2 g/kg）在抗炎作用方面均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），且存在着一定的量效关系，为大丁草民间治疗湿热泻痢、热淋、风湿关节痛、痈疖肿毒等病证提供了药效学理论基础。同剂量水提物的效果优于醇提物，推测其与发挥抗炎作用的有效成分水溶性较好有关，这与民间应用大丁草水煎液治疗病证的方法一致。同时，本课题组对大丁草中发挥抗炎作用具体有效成分及其作用机制正在进一步研究中。