血浆microRNA-135a及microRNA-210在轻度认知损害患者中的检测价值

胡轶虹，白春艳，李宗树，吕金珠，杨春丽，孙宏侠

随着全球老龄化的进程，阿尔茨海默病成为全球医疗界急于攻克的难题之一。临床病理研究指出本病有个比较长的临床前阶段；事实上认为脑组织病理，包括淀粉样斑及神经纤维缠结，早于典型神经细胞死亡及后续认知及行为症状出现的10～20 y[1]。因此，体液和影像的生物学标志物能在症状初期或临床前阶段得到证实，在这一时期干预治疗，可能更好的保留认知功能[2]。本研究聚焦于轻度认知损害阶段，检测患者的血浆microRNA-135a及microRNA-210，探讨其作为MCI早期诊断标志物的价值。

1 材料和方法

1.1 实验分组 (1)正常对照组(AMC)，年龄≥60岁，保留正常的日常生活活动能力，无神经系统疾病、精神疾病及其他可导致认知功能损害的医疗情况;(2)轻度认知损害组(MCI)，年龄≥60岁，用简易智力状态检查量表(MMSE)及临床痴呆评定量表(CDR)进行认知功能临床评价。认知损害诊断标准：(1) 28≥MMSE≥21；(2)非痴呆；(3)记忆力减退主诉；(4)保存一般认知功能；(5)较完整的日常生活活动能力(允许2个或更少的问题:电话、准备三餐、理财、完成家务);(6)根据教育程度的校正：12 y以下+1分；6 y以下+2分。根据头部CT或MRI影像学检查及Hachinski缺血量表评分分为：(1)VD-MCI组： Hachinski缺血量表评分≥7分伴有影像学脑血管病改变；(2)AD-MCI组：Hachinski缺血量表评分<4分且无影像学脑血管病改变。3组均行全面体格检查和神经系统检查，实验室检查(即血常规、尿常规、血生化、维生素B12和叶酸水平、甲状腺功能、同型半胱氨酸)和神经影像学(即核磁共振或CT)检查。本研究所有受试者均知情同意。

1.2 标本采集 空腹12 h后，用EDTA真空采血管采血，立即在1380×g离心5 min。样本保存在4 ℃等待血浆制备，其后用1.5 ml Eppendorf管分装，储存在-80 ℃，直到进一步使用。

1.3 小RNA提取及microRNA-135a及microRNA-210测定 应用miENeasy Mini Kit(Qiagen，德国)，逆转录试剂盒 (Qiagen，德国)，按照说明书进行RT-qPCR,以cel-miR-39为外参，使用2-ΔCT法计算microRNA-135a及microRNA-210水平。

1.4 统计学分析 不同组间定量数据的比较应用配对t检验。对于分类变量应用χ2检验。多个组间定量数据比较用ANOVA方差分析。miRNA水平与MMSE评分相关性用Pearson相关系数分析。

2 结 果

2.1 临床资料 筛选2016年-2018年于吉林省人民医院神经内科门诊及住院患者，根据入组标准，共筛选出80人，年龄为60～94岁，其中AMC为28人，男13人，女15人，年龄中位数69岁；VD-MCI 28人，男19人，女9人，年龄中位数72岁；AD-MCI组24人，男13人，女11人，年龄中位数73岁。采用χ2检验对3组患者的性别构成进行分析，结果显示3组患者的性别构成并无统计学差异(P=0.199，P>0.05)，应用t检验对年龄进行比较，差异无显著性(P>0.05)(见表1)。

2.2 血浆microRNA-135a检测AMC组患者血浆microRNA-135a水平为(9.87×10-7±5.66×10-7)；VD-MCI组患者血浆microRNA-135a水平为(4.17×10-7±8.35×10-8)；AD-MCI组血浆microRNA-135a水平为(2.83×10-7±1.72×10-7)。采用ANOVA方差分析对3组患者的血浆microRNA-135a进行分析，结果显示3组患者组间microRNA-135a水平存在显著差异(F=30.76,P=0.00,P<0.05)(见图1、表2)。

2.3 血浆microRNA-210检测 AMC组患者血浆microRNA-210水平为(1.30×10-5±7.07×10-6)；VD-MCI组血浆microRNA-210水平为(4.27×10-5±1.09×10-5)；AD-MCI组血浆microRNA-210水平为(6.96×10-5±2.48×10-5)。采用ANOVA方差分析对3组患者的血浆microRNA-210进行分析，结果显示3组间存在显著差异(F=80.43,P=0.00,P<0.05)(见表2、图2)。

2.4 MMSE评分与microRNA水平相关性分析 对VD-MCI组的MMSE评分与血浆microRNA两个指标进行Pearson相关性分析，统计结果显示，MMSE评分与血浆microRNA-135a水平间(r=0.20,P=0.31,P>0.05)，与血浆microRNA-210水平间(r=-0.12，P=0.56,P>0.05)并无明显统计学相关性。对AD-MCI组的MMSE评分与血浆microRNA两个指标进行Pearson相关性分析，结果显示，MMSE评分与血浆microRNA-135a水平间(r=0.24，P=0.25,P>0.05)；血浆microRNA-210水平间(r=-0.28，P=0.18，P>0.05)并无显著相关性。

表1 入组患者基本临床资料

3组患者年龄及性别均无明显差异P>0.05

表2 3组患者的血浆microRNA-135a及microRNA-210检测比较

注：VD-MCI组及AD-MCI组血浆microRNA-135a明显下降，且AD-MCI组下降更为明显(P<0.05)；VD-MCI组及AD-MCI组血浆microRNA-210明显升高，且AD-MCI组升高更为明显(P<0.05)

注：A代表AMC组;B代表VD-MCI组;C代表AD-MCI组。VD-MCI组及AD-MCI组血浆microRNA-135a明显下降，且AD-MCI组下降更为明显(P<0.05)

图1 血浆microRNA-135a检测结果曲线图

注：A代表AMC组;B代表VD-MCI组;C代表AD-MCI组。VD-MCI组及AD-MCI组血浆microRNA-210明显升高，且AD-MCI组升高更为明显(P<0.05)

图2 血浆microRNA-210检测结果曲线图

3 讨 论

目前，AD和其他形式的痴呆的诊断基于分析患者的认知功能。神经元之间的淀粉样斑块，神经纤维tau蛋白缠结和脑组织的整体萎缩是AD的特点，有很多基于这些现象而尝试开发诊断检查。最近发表的数据显示高灵敏度的AD检测，包括作为生物标记物的脑脊液(CSF)中β淀粉样蛋白1-42，总tau蛋白，磷酸化tau 181P蛋白的检测[3,4]。然而，CSF的侵袭性收集过程限制了这些检测方法的日常临床使用。新的成像技术，包括体内检测β淀粉样蛋白沉积的PET扫描[5～7]，越来越敏感特异，但不适合初次筛选。一些团队基于大量的分析人类血液中蛋白质或抗体[8～10]，报道了关于AD诊断的血液化验分析，这极大的鼓舞了科学工作者继续在此方向进行深入探讨。

microRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，通过调控转录后基因表达发挥其生物学功能。近年来研究发现， miRNA在大脑发育、神经元分化、突触联系和树突棘形成等过程中发挥重要作用[11]。而miRNA表达异常参与了阿尔茨海默病等认知功能障碍性疾病的发病过程， 且这种表达异常不仅在病变脑区可以检测到，在血浆、脑脊液等外周体液亦可发现[12]。这些发现使得将miRNA作为标记物早期检测和评估认知功能障碍成为可能。更为重要的是，由于可以靶向调节多种基因，miRNA可能是我们进一步理解认知功能障碍发病机制和研发新型药物的关键分子[13]。

国内学者刘辰庚等研究发现，APP/PS1双转基因AD小鼠模型海马组织中microRNA-135a较野生型小鼠显著下调，且AD小鼠模型CSF和血清中的microRNA-135a亦显著下调[14]。由于microRNA-135a相对BACE1和Aβ42而言处于生物级联作用的上游，故microRNA-135a可能对于AD的早期诊断有潜在帮助。这个猜想也在与Aβ42阳性率的横向比较中得以印证-外周血microRNA-135a可能是较Aβ42更适宜的AD诊断，特别是早期诊断的标志物[15]。本研究发现microRNA-135a在轻度认知损害患者中降低，在AD源性MCI中降低更为明显，与刘辰庚的实验研究一致，证明microRNA-135a可作为AD源性MCI早期筛选诊断标志物。

microRNA-210的上调与很多实体肿瘤相关，而且它的升高常提示预后不良。新近研究发现，microRNA-210与细胞循环调节、细胞再生、分化、血管再生等有关[16～18]。然而，在活体内，microRNA-210在缺血后的神经形成中起促进作用[19]还是抑制作用[20]仍处于争论中。Lou[21]等研究认为，microRNA-210参与了在脑缺血后的血管新生，在缺血后的脑组织中表达增加。本研究发现，在轻度认知损害的患者中，microRNA-210明显升高，在AD源性MCI中升高更为明显，这与我们的实验设想有差距。因此，需要我们继续扩大研究的样本量，并对入组的患者进行随访研究。总之，今后还需要对特定miRNA的靶基因、上下游通路及其是否具有逆转认知下降的功能进行更为深入的研究和机制探讨。