O型口蹄疫免疫抗体检测筛选法在兽医实验室抗体检测中的研究与应用

王 琴,李成明

（1.甘肃省瓜州县畜牧兽医局，甘肃 酒泉736100；2.甘肃省柳园动植物检疫检查站,甘肃 酒泉736100）

肉羊产业是我县畜牧业的重要组成部分，经多年扶持发展，已实现了小群体汇集大规模，标准化、规模化生产，年饲养量已达到130 万只，成为酒泉地区重要的肉羊及其产品生产地。随着饲养规模的不断加大，贩运活动的越发频繁，小反刍兽疫和口蹄疫对养羊业造成严重威胁，不仅对经济生产构成了严重的威胁，并且也暴露出防疫工作中的一些不足。为进一步提升我县对口蹄疫的防控水平，确保肉羊产业安全发展和人民群众健康，结合我县肉羊产业发展中存在的重点难点技术问题，我们规划并实施了“免疫抗体筛选法在羊场口蹄疫防控中的研究与应用”项目，节省了大量的免疫抗体检测成本，实际效果经得起实践检验。

1 主要研究内容

口蹄疫是危害饲养业最严重的传染病之一，一旦发病，流行快、传播广，对畜牧业造成的经济损失大。根据《中华人民共和国动物防疫法》规定，口蹄疫被划为一类动物传染病，口蹄疫经过多年的免疫防治，加上优质疫苗的应用，其在一定区域的流行已经得到了控制，但随着养羊业形势的变化，羊只的频繁调运和长途运输，为该病的发生和传播创造了有利的条件，为疫病的防治增加了难度；加之养殖场户对动物疫病防治形势认识不清，导致口蹄疫、小反刍兽疫、布病等疫病长期存在和反复流行。

在实验室抗体检测中快速、高效完成抗体检测结果，并根据检测结果指导企业进行强化免疫，完善修改免疫程序，同时降低检测成本，提高检测数量，能使检测结果更具说服力。为制定科学合理的免疫程序提供一些必要的理论依据。在养殖生产中进场检疫和产地检疫工作中推广应用该免疫抗体筛选法，倒逼养殖企业重视疫苗接种工作，发挥防疫主体责任，对于预防动物疫病的发生、提高养殖效益和维护百姓食品安全具有十分重要的意义。

2 主要研究方法

口蹄疫免疫抗体正向间接血凝试验实验室筛选法。

2.1 研究方向

（1）抗体检测技术的作用。

应用于进场检疫和产地检疫检测，促进动物防疫工作更科学高效，提高防疫水平。

（2）探索研发实验室更简捷，快速，高效的检测方法。

结合实验室实际情况，探索研究更经济高效的免疫抗体检测筛选法。

2.2 研究方法

当前对口蹄疫的抗体检测主要有液相阻断ELISA 法和正向间接血凝法。液相阻断法反应灵敏，可定量检测羊只抗体水平。但常规口蹄疫液相阻断ELISA 检测方法步骤较多、操作繁琐、费时，需要对动物血清进行稀释，一份血清至少要稀释四个滴度，每个试剂盒仅能检测100-200 份样品，不利于基层大规模检测。正向间接血凝法相较于液相阻断法检测试剂盒成本较低，操作简便。

实验通过研究建立了一种血凝和血凝抑制试验筛选方法，包括以下步骤：抗原和血清的稀释、血凝试验、血凝抑制试验筛选。血凝抑制试验筛选中通过采用1 块稀释板和3 块反应板，一次性检测80 份血清样品，筛选出阳性样品最终判定免疫抗体水平，相较传统方法可节省抗原一半以上。本发明用较少的抗原检测较多的样品，达到检测抗体水平高低的目的，检测方法简单，检测结果准确可靠，检测效率高，最大限度的减少了工作量，降低了对实验人员数量的需求，很好的解决基层实验室检测经费紧张，检测试剂有限，检测数量大的问题，本筛选方法尤其适用于基层农村动物防疫检疫机构。

应用口蹄疫血清抗体检测技术，对立林公司养殖场羊只按10%比例抽样检测，掌握口蹄疫免疫情况，及时补免，确保该场养殖羊只对口蹄疫疫病有足够的免疫力。

3 研究结果

口蹄疫实验室筛选方法的推广和应用。在精准扶贫中标企业羊只投放和进疆羊只调引中按照10%比例随机抽检，共检测29 批次，共计检测2120份样品，合格数量1101，平均合格率50.05%，合格率由2018年的42.19%上升至2019年的83.33%(截止2019年4月）。

口蹄疫免疫抗体检测结果表（单位：只、%）

在春秋免疫抗体检测中，2016-2019年检测4743 份样品，由于筛选法的应用，检测样品逐年增加，范围逐年扩大，更加真实的反映了防疫整体情况，为防疫工作提供真实有效数据。

（2016.5-2019.5）瓜州县春秋免疫抗体检测试剂成本比较核算常规（正向间接血凝试验）免疫抗体检测数量统计及试剂成本统计

筛选法（正向间接血凝试验）免疫抗体检测数量统计及试剂成本统计

对比正向间接血凝实验数据可以得出：常规方法耗费试剂总成本为47430 元，筛选法一个目标滴度耗费试剂成本为7114.5 元，两个目标滴度为14229 元，筛选法所耗费成本仅为常规方法的15%-30%，可以节约试剂成本70-85%.在同时检测样本总计4743 份情况下，节约成本33201-40315.5 元。

常规（液相阻断）免疫抗体检测数量统计及试剂成本统计

筛选法（液相阻断）免疫抗体检测数量统计及试剂成本统计

对比液相阻断法数据可以得出：常规方法耗费总成本为59287.5 元，筛选法1 个目标滴度试剂成本为19920.6 元，2 个目标滴度试剂成本为39841.2 元。在同时检测样本总计4743 份情况下，节约成本19920.6 元-39366.9 元。筛选法所耗费成本为常规方法的33.6-67.2%。

选用正向血凝法成本节约率为70-85%，选用液相阻断法成本节约率为33.6-67.2%，正向血凝法在成本节约方面优于液相阻断法，在数据准确性方面，液相阻断法则优于正向血凝法，但对于基层实验室而言，因正向间接血凝试验操作较为简单，其可操作性要明显强于液相阻断法。通过试验比对，用液相阻断法复核正向间接血凝试验结果，符合率达到96%，两种试验方法误差率仅为4%。

目前基层实验室普遍存在经费少、人员少、检测任务量庞大的困境，通过选用筛选法，可以以较少的试验经费、较少的实验人员，实现大范围、大批量的样本检测，使得检测结果更加真实可靠，以便更加科学的制定行之有效的防控措施，保障区域畜牧业健康有序发展。

依据口蹄疫免疫抗体检测结果整体偏低的现状，对于新调入的羔羊进行抗体检测，若抗体检测结果较差，集中免疫一次，30 天后，进行第二次强化免疫，日后进行常规免疫，对于新调入成年母羊，必须全部进行入场检测，若抗体水平较低，则及时进行补针。

4 问题及建议

4.1 存在问题

一是基层防疫技术员缺乏，水平和能力有限，服务的质量、服务的水平、防疫技术手段跟不上现代畜牧业发展的需要。二是基层防疫基础设施建设满足不了当前防疫形势需要，亟需改进完善。三是养殖（户）企业对当前防疫形势认识不清，缺乏防疫的意识，对防疫的重要性认识不足，防疫经费投入不足，缺乏必要的监测意识和手段。

4.2 建议

一是强化科技创新。重点是结合工作实际，紧密结合禽流感、口蹄疫、布病、小反刍兽疫等严重危害养殖业发展的现状，联合相关科研院所，组织开展科技攻关，加强对现有防控技术的改进和重大动物疫病诊断、监测手段的研究推广，实现防控技术和防控水平新突破。

二是强化防控制度建设与落实。认真贯彻“政府负总责、部门各司其职，属地管理、分级负责”的原则，坚持依法防疫、预防为主、群防群控、果断处置的方针，按照以检促防，以监促免要求，健全动物疫病防控追溯体系，完善动物疫病防控责任制，全面推行强制免疫制度。

三是强力推进动物防疫基础设施建设。以实施乡镇畜牧兽医站动物防疫基础设施建设为目标，加大对基层站的投入，改善技术服务条件，整体提升疫病防控工作能力和动物疫情预警能力。

四是强化防疫队伍能力建设。在全面实施技术人员继续教育的同时，坚持实战、实用、提升、见效的原则，在培养领军人才同时，围绕防疫新技术、新要求、新形势，结合县乡村级防疫员队伍建设现状，开展新一轮的强化提升培训考核，全面提升动物防疫人员业务素质和职业道德素养。

5 技术成果的推广应用

该技术方法经过瓜州县兽医实验室的试验及推广应用，取得了明显的效果。瓜州县畜牧兽医局依靠全县各乡、镇畜牧兽医站这一网络体系，强化了新技术的推广。在推广应用过程中，以立林公司羊场，良源、丰杰等规模养羊场为中心，依靠其辐射带动作用，推动免疫抗体检测筛选法在养羊业中的应用。根据《瓜州县2016-2020年动物疫病防控规划》，依托基础条件、资源优势和科技进步，通过生产方式创新、增长方式创新、组织方式创新，提升竞争力，全面提升瓜州县畜牧产业的生产水平、产品质量和产业质量。瓜州县羊饲养量130 万只，出栏量60 万只，要清楚认识到，要实现该技术方法全面推广，为养殖业提供最有力的防疫保障的目标并不容易。目前有健全的县、乡、村三级动物防疫体系，积极推行" 政府包密度，业务部门包质量" 的动物防疫责任制，县、乡政府和业务部门、业务人员分别签定动物防疫责任书，重视年终考核，兑现奖罚，强化疫情监测、基础免疫、市场检疫等措施，狠抓羊布病、口蹄疫、小反刍兽疫为主的重大动物疫病防治，才能有效地控制重大动物疫病的流行。

利用免疫抗体检测技术，既可以充分利用和发挥我县的兽医实验室资源优势，也可以为我县畜牧业生产的健康发展提供真实科学的技术指导保证。我县是一个畜牧养殖大县，大力发展畜牧业生产，增加肉、蛋的产量，提高肉、蛋奶的品质，在我县有着得天独厚的资源优势和巨大的发展潜力。但是，广大养殖户或农民对规模化生产技术掌握不足，对生产过程中如何根据畜禽的生理特性，提高饲料转化率，提高畜禽产品的品质，最大限度地发挥畜禽的生产性能和各种致病因素造成的隐性侵袭缺乏正确的认识。在一些规模化养殖生产中，滥用各种抗生素或化学类添加剂，造成肉、蛋、奶等畜禽产品中残留量的增加，对人民生活健康造成了潜在的危害，也产生不良的社会影响。从试验结果得出结论，该试验能够有效提高羊抗病力、减少发病率，减少兽药投入成本，提高经济效益。实验室检测，已成为研究动物疫病的主要手段，对解决抗生素残留问题，提高生产率，发展绿色畜牧业，满足人们的食品安全需求，提高有机体的免疫机能等方面有着广阔的应用前景。