多指标正交试验法考察金匮薯蓣膏提取工艺△

赵斌斌，周小雅*，赖飞娥，常雪松，黄敏，梁国成，陈壮

1.广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011

薯蓣丸为汉代名医张仲景医著《金匮要略》中收载的扶正袪邪经典名方，由山药、甘草等21味药组成，其市场前景广阔、开发政策环境良好与其开发的深度与广度不足的矛盾非常突出。目前市场无薯蓣膏成药产品供应，且已批准生产的薯蓣丸成药质量标准与现代药品监测技术的发展不相适应，难以满足需求、控制质量[1]。因此，本课题组将薯蓣膏制备作为研究课题。提取是将薯蓣丸改型为金匮薯蓣膏的关键过程。本研究以薯蓣皂苷、甘草酸、甘草苷等有效成分为指标，采用正交试验法对其提取工艺进行考察，为控制金匮薯蓣膏质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

快速水分测定仪[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；安捷伦高效液相色谱仪(1260)；TU-1901双光束紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；Practum612-1CN电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；EL104型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；铜水浴锅；电炉；PS-20A洁康牌超声波清洗器(东莞市洁康超声波设备有限公司)；高速离心机(北京京立离心机有限公司)；SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药

药材购于贵港市百草坊中药饮片有限公司；甘草苷、甘草酸铵、薯蓣皂苷(中国食品药品检定研究院，批号分别为：111610-201106、110731-201116、111707-201402)；金匮薯蓣膏(课题组自制，批号分别为：20170702B、20170702B、20170703A、20170703B、20170704A、20170704B、20170704C、20170704D、20170705A、20170705B)；甲醇、乙腈(德国默克公司，色谱醇)；磷酸(广东光华科技股份有限公司，批号：20140929，分析纯)；娃哈哈纯净水；乙醇(广东光华科技股份有限公司，批号：20141008，分析纯)。

2 方法与结果

2.1 含量检测方法

2.1.1 对照品溶液制备 取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、薯蓣皂苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每1 mL含甘草苷992 μg、甘草酸铵1200 μg、薯蓣皂苷720 μg的溶液，稀释成不同浓度。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，流速为1.0 mL·min-1进行梯度洗脱，甘草酸、甘草苷洗脱条件见表1，检测波长为237 nm；薯蓣皂苷洗脱条件见表2，检测波长为202 nm，进样量20 μL。

注：1.薯蓣皂苷标准品；2.样品；3.阴性对照品。图1 薯蓣皂苷色谱图

2.1.3 线性关系考察 分别吸取甘草苷、甘草酸对照品溶液，加70%乙醇稀成释质量浓度分别为992、1200、720 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸、薯蓣皂苷对照品溶液，再稀释成6个不同浓度的对照品溶液，分别精密吸取上述7种不同浓度的对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱议中，按2.1.2色谱条件分析测定其峰面积，以对照品溶液浓度(μg·mL-1)为横坐标，其色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，甘草苷：Y=9.441X+47.88，r=0.999 8；甘草酸：Y=2.641X+13.86，r=0.999 8；薯蓣皂苷：Y=3.431X+38.043，r=0.999 4。

2.1.4 精密度试验 精密吸取甘草苷、甘草酸、薯蓣皂苷对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD分别为0.79%、0.46%、1.42%(见表1)，表明精密度良好，符合含量测定的要求。

2.1.5 重复性试验 取同一批样品6份，每份1 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，测定含量，计算测定结果甘草苷、甘草酸和薯蓣皂苷RSD分别为0.47%、0.23%、0.96%，表明重复性良好，符合含量测定的要求。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测定其含量，计算在24 h内甘草苷、甘草酸和薯蓣皂苷的RSD分别为1.14%、1.06%、1.97%，表明稳定性良好，符合含量测定的要求。

2.1.7 加样回收试验 取已知含量的薯蓣膏样品6份，每份1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，每份精密加入质量浓度为2 mg·mL-1甘草苷对照品溶液1 mL，质量浓度为3.6 mg·mL-1甘草酸铵对照品溶液1 mL，质量浓度为2.1 mg·mL-1薯蓣皂苷对照品溶液1 mL，加入70%乙醇47 mL，称定质量，超声提取1 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密移取20 mL，水浴蒸干，用4 mL70%乙醇溶解，微孔滤膜过滤后既得样品，进样20 μL，计算回收率和RSD值。结果见表1～3。

表1 甘草苷加样回收率(n=6)

表2 甘草酸加样回收率(n=6)

表3 薯蓣皂苷加样回收率(n=6)

2.2 提取工艺考察

2.2.1 供试品溶液制备 精密移取待检测薯蓣膏提取液20 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，放置24 h，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密移取滤液20 mL，置蒸发皿中蒸干，用4 mL 70%乙醇溶解，经微孔滤膜过滤即得。

2.2.2 单因素考察 取3份处方量的药材，其中一份打成细粉，第二份打成粗粉，第三份以饮片提取；加水1000 mL，煎煮30 min制成样品。按2.2.1的方法制成供试品溶液，按2.1.2的色谱条件，分别测定薯蓣皂苷含量和甘草苷、甘草酸含量。同样方法分别考察不同浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数、用水量等条件下制备的样品中甘草苷、甘草酸和薯蓣皂苷含量。结果细粉提取容易煮糊，故不考虑细粉提取，其他结果以饮片投料、浸溶时间40 min时3种成分含量测定结果较好，且煎煮时间超过120 min以后成分含量没有明显增加，煎煮3次与煎煮2次的煎液成分含量相当(表4～8)。

表4 粉碎度的影响 μg

表5 不同浸泡时间的影响 μg

表6 不同煎煮时间的影响 μg

表7 不同煎煮次数的影响 μg

表8 不同用水量的影响 μg

2.2.3 正交试验 选择影响提取效果的4个主要因素：头煎水量(A)、头煎时间(B)、二煎水量(C)、二煎时间(D)进行考察。各因素选择三个水平(表9)按L9(34)正交设计进行9次实验(表10)，分别检测不同条件下薯蓣皂苷、甘草苷和甘草酸含量，并进行方差分析。

根据统计结果(表11)可知，各因素薯蓣皂苷影响依次为B>A>C>D，最佳组合因素为A2B3C3D2；对甘草苷的影响依次为B>D>C>A，最佳组合因素为A2B3C3D3；对甘草酸的影响依次为B>A>C>D，最佳组合因素为A2B3C3D3。综合考虑确定最佳工艺条件为A2B3C3D3，即头煎水量6倍，头煎90 min，二煎水量6倍，二煎时间60 min。

表9 因素水平表

表10 L9(34)正交试验设计

表11 不同煎煮条件对成分含量的影响

2.2.4 验证实验 为了确保该提取工艺的可行性与合理性，按照上述提取方案，进行了6次验证实验。结果见表12。

表12 金匮薯蓣膏样品含量测定(n=6) μg·g-1

3 讨论

据文献报道薯蓣丸在临床上对慢性疲劳综合征、围绝经期女性慢性荨麻疹以及辅助治疗肝癌恶病质、肿瘤相关性厌食均有显著疗效[3-7]，应用中既有用蜜丸也有用汤剂。依据原方改制成煎膏剂金匮薯蓣膏，融汤剂、蜜丸的优点于一体，能够最大限度保留原方汤剂和蜜丸剂的共同特点，更加契合养生、保健的用药习惯与消费需求。原方中重用薯蓣(山药)、甘草各为君、臣[8]，用药剂量远大于其他药味。而薯蓣皂苷、甘草酸和甘草苷分别是山药和甘草的重要特征有效成分[9-13]，处方中含山药、甘草的复方制剂也多以这些成分建立制剂定量标准[14-15]。故本研究以之为定量指标建立质量控制标准对生产工艺进行考察，有一定的理论与实验依据。

在剂型改制过程中，提取工艺是其技术关键。本研究参考文献报道[16-18]，以薯蓣皂苷、甘草酸、甘草苷等有效成分为检测指标，通过正交试验设计对金匮薯蓣膏的提取工艺因素进行筛选。研究结果表明，以中药饮片形式投料，加6倍水量煎煮90 min，过滤后再加6倍水量煎煮时间60 min，即可最大限度保留有效成分。根据此工艺制备的金匮薯蓣膏中薯蓣皂苷、甘草酸、甘草苷质量分数分别为160～316、1440～1792、363～766 μg·g-1。考虑到中药材的来源、加工方法以及大生产与小批量实验的差异，金匮薯蓣膏的质量定量标准以薯蓣皂苷、甘草酸、甘草质量分数不低于160、1440、363 μg·g-1为宜，该工艺可为大规模生产金匮薯蓣膏建立生产操作规程提供参考。在单因素试验中发现，煎煮120 min所测得的甘草酸和甘草苷含量增加比例并不高，薯蓣皂苷含量还稍有下降。继续延长煎煮时间还会导致生产成本增加。故综合考虑，在优化工艺考察时排除了煎煮时间120 min这个考察条件。

文献报道了以甘草酸为检测目标建立的薯蓣丸质量标准[19]，高效液相色谱法检测薯蓣皂苷元含量建立质量标准在其他制剂中有较多报道[20]。但以高效液相色谱法同时检测甘草酸、甘草苷和薯蓣皂苷3种组分含量尚未见报道。就金匮薯蓣膏而言，处方组分多、成分复杂是建立质量控制标准的主要难点。研究结果表明，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，进样量20 μL，以1.0 mL·min-1流速进行梯度洗脱，甘草苷、甘草酸和薯蓣皂苷分别在49.5～992、30～1200、36～720 μg·mL-1具有良好的线性关系。满足一次进样同时检测3种有效成分含量的要求，操作方法较为简便，可为建立金匮薯蓣膏质量标准提供依据。但实验结果表明，样品中3种检测成分的含量差距较大，同等取样量时甘草酸峰值高而薯蓣皂苷峰值偏低，是否可以通过改变取样量分别检测不同成分含量，亦或是以参考薯蓣皂苷元为检测目标建立质量标准更为理想，还有待进一步研究。