木鳖子茎蔓无菌培养及植株再生研究

高 燕，姜 艳*，李薇莎，李桂琳，李泽生，杨燕芳

（1.云南省德宏热带农业科学研究所，云南瑞丽678600；2.瑞丽鑫水园林花卉有限公司，云南瑞丽678600）

木鳖子（Momordica cochinchinensis）又名木鳖藤，是一种葫芦科苦瓜属药食同源的多年生草质藤本，为常用中药［1］，生于海拔450～1 100 m的山坡、林缘，土层较深厚的地方，喜温暖、潮湿的气候和向阳的环境，我国主要分布于湖南、台湾、广西、四川、云南等地［2］。木鳖子嫩茎尖可食用，以根入药，种仁含脂肪油约41.2%，油中组分有29.02%的α-桐酸（α-eleostearic acid）［3-4］。已知化学成分还有海藻糖（mgcose）［5］、α-菠菜甾醇（αspinasterol）［6］、木鳖子酸（momordic acid）、齐墩果酸（oleanolic acid）、甾醇（sterol）［7］、木鳖糖蛋白［8-9］、氨基酸及蛋白质等。据《中国药典》记载，木鳖子具有散结消肿、攻毒疗疮的功效，可用于治疗疮疡肿毒、乳痈、瘰疬、痔瘘、干癣、秃疮等症［10］。迄今为止，国内外对于木鳖子的研究较少，仅有其化学成分的相关分析报道。

木鳖子的繁殖方法主要有种子播种和根头繁殖法。种子播种繁殖的植株，由于种子间差异大，雌雄株差异明显，要求在开花时拔除多数雄株，只保留少数雄株，以供授粉；根头繁殖选择雌株根头，将根上的芽数切成种根，伤口易腐烂，原材料浪费大，成活率低。为此，需要利用植物组织培养技术对野生的木鳖子品种进行组培育苗技术研究，以突破其育苗技术的瓶颈。目前有关木鳖子的组培育苗技术还未见报道，笔者就此对木鳖子幼嫩茎蔓组织培养技术中的愈伤组织诱导、继代增殖培养、生根培养和炼苗移栽方法等关键技术进行了初步研究，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试木鳖子幼嫩茎蔓取自瑞丽鑫水园林花卉有限公司种植基地（2017年4月），剪下的幼嫩茎蔓放入玻璃瓶中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织诱导分化培养

选择生长健壮、无病虫害的幼嫩茎蔓，去除多余叶片后切成小段，放入0.1%的洗衣粉或洗洁剂中浸泡3～5 min，经自来水冲洗10～15 min，纯净水清洗1～2次，用浓度75%酒精消毒30 s，0.1%HgCl2灭菌5 min，无菌水冲洗5～6次，然后用无菌过滤纸吸干水分，切成长2～3 cm带1～2节的茎蔓，接种于诱导培养基中培养。每种培养基接30个节，每处理接种30瓶，每瓶接种3个茎节，暗培养7 d后再转入光照培养60 d，光照强度为1 800～2 000 lx，光照时间 10 h/d，pH 5.8～6.0，培养温度（25±2）℃。统计愈伤组织数，计算愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率＝（愈伤组织数/接种外植体数）×100%。试验愈伤组织诱导培养基见表1，木鳖子茎蔓愈伤组织的诱导分化最适宜培养基为MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

表1 愈伤诱导分化培养基 m g/L

1.2.2 继代增殖分化培养

将生长至4 cm以上的不定芽切成带1～2节的茎蔓，接种于继代增殖分化培养基中培养，光照强度为2 000～2 200 lx，光照时间12 h/d，培养时间60 d。统计增殖苗数，计算增殖倍数。增殖倍数＝增殖苗数/原接种小苗数。试验最适宜继代增殖培养基为MS6+6-BA0.6mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯泥2%+活性炭1 g/L+蔗糖30 g/L（表 2）。

表2 继代增殖分化培养基 m g/L

1.2.3 生根培养

待不定芽小芽长至2 cm以上，切成单株接种于生根培养基中培养，光照强度为2 200～2 400 lx，光照时间12 h/d。每10 d观察、记录生根状况，60 d后测定根长，统计生根数，计算生根率。生根率＝生根苗数/接种小苗数×100%。试验最佳生根培养基为MS+NAA 0.4 mg/L+香蕉泥5%+活性炭2 g/L+蔗糖20 g/L（表3）。

表3 生根培养基 m g/L

1.2.4 炼苗与移栽

将株高3～5 cm，根长2～4 cm，生根数在3根以上的瓶苗置于自然光温室大棚苗床上炼苗。10 d后取出生根苗，洗净根部的培养基，放入1 000倍多菌灵溶液浸泡5 min，捞出晾干至根发白，移栽于不同基质中，浇透定根水，荫蔽度85%，相对湿度70%～80%，温度22～30℃。移栽7 d后，用1 000倍多菌灵溶液喷雾消毒，15 d后用3 000倍低浓度叶面肥喷施。移栽前5 d，将基质用1 000倍多菌灵溶液喷洒作消毒处理，移栽的混合基质为腐殖土∶火烧土∶腐熟艾蒿（体积比5∶3∶2）。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导分化培养

接种10 d后，茎节切口处开始膨大，30 d后切口出现乳白色紧密状愈伤组织，60 d后逐渐形成黄绿色愈伤组织块。愈伤组织诱导率及颜色、结构和状态在不同培养基中表现差异较明显（表4）。随着6-BA浓度的升高，愈伤组织的生长量增大，当6-BA为0.8 mg/L（A5）时，愈伤组织生长量状态最好，呈黄绿色，结构较紧密，当6-BA为1.2 mg/L（A8）时，愈伤组织呈黄竭色，结构较松散；同时添加6-BA、NAA、KT的培养基中茎蔓切口产生的愈伤组织比单一添加6-BA的生长量大，其中添加6-BA 0.8 mg/L和NAA 0.1 mg/L的愈伤组织生长状态最好，呈黄绿色，结构紧密。

表4 木鳖子茎蔓愈伤组织的诱导率

将愈伤组织分别转接至配方相同的分化培养基上进行继代增殖分化培养，7 d后愈伤组织颜色由乳白色变成黄绿色，愈伤组织表面分化出不定芽（图1）。不定芽随着6-BA浓度的升高而增加，当6-BA为0.8 mg/L（A5）时，愈伤组织诱导率最高，达 66.7%，当 6-BA 为1.2 mg/L（A8）时，愈伤组织诱导率下降至53.3%，添加NAA 0.1 mg/L或KT 0.1 mg/L培养基上的愈伤组织诱导率比单纯添加6-BA的要高。因此，木鳖子茎蔓愈伤组织的诱导分化最适宜培养基为MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

图1 愈伤组织分化出不定芽

2.2 不同激素配比对不定芽增殖分化的影响

试验结果（表5、图2）表明，6-BA为0.6 mg/L（B4）的培养基增殖倍数最高，为5.6，添加NAA 0.2 mg/L培养基上的不定芽生长快而整齐，叶片大而宽，茎节短而粗壮，有利于后期生根培养。因此，最适宜继代增殖培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯泥2%+活性炭1g/L+蔗糖30 g/L。

图2 继代增殖培养

表5 不同激素配比对不定芽增殖分化的影响

2.3 再生植株的生根培养

试验结果（表6）显示，NAA和IBA均能使不定芽生根，生根率达100%，但不同激素种类、不同浓度对不定芽生根效果不同。观察发现，木鳖子再生植株的根出现较慢，15 d才开始有乳白色根壮突起，而后慢慢伸长，40 d分化出白色根（图3）。添加NAA 的培养基（C1、C2、C3），不定芽生根比IBA早，生根数多，根粗而短，但添加IBA的培养基（C4、C5、C6）上的不定芽生根普遍比 NAA 长，生根数少，根长而细。根的多少和粗度是影响生根苗移栽成活率的主要因素，根多而粗壮，成活率高；根少而细则成活率低。因此，最佳生根培养基为MS+NAA 0.4 mg/L+香蕉泥5%+活性炭2 g/L+蔗糖20 g/L，平均生根数达4.8条，平均根长3.9 cm（图 4）。

表6 不同激素浓度对生根培养的影响

图3 4 0 d生根状况

图4 6 0 d生根状况

2.4 炼苗与移栽

从移栽30 d后的调查结果（表7）看，试验各处理的成活率与不同栽培基质配比的透气、保水性有关。处理D1透气性差，保水时间相对较长，移栽成活率最低，为73.3%；处理D2、D3透气性好，保水持续时间较短，成活率较低，分别为86.7%和90%；处理D4为腐殖土∶火烧土∶腐熟艾蒿（体积比5∶3∶2）的混合基质最好，透气适宜，保水性较好，移栽成活率最高，达93.3%。

表7 不同基质配比对移栽成活率的影响

3 结论

试验研究结果，以高浓度6-BA 0.8 mg/L诱导木鳖子茎蔓，切口处产生愈伤组织，低浓度6-BA 0.6 mg/L诱导愈伤组织分化再生植株，NAA和KT对愈伤组织诱导起到一定的促进作用，最适宜愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L，愈伤组织诱导分化率达66.7%。

在不定芽继代增殖分化的过程中，6-BA浓度对继代增殖效率起到决定性的作用，生长素NAA和低浓度的马铃薯泥对不定芽生长增殖分化有一定的促进作用，最适宜不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯泥2%+活性炭1g/L+蔗糖30 g/L，增殖倍数达5.6倍，不定芽分化多，生长健壮，茎节短。

在生根培养基中添加香蕉泥对木鳖子不定芽生根有促进作用［11］，NAA对不定芽生根效果好于IBA，最适宜不定芽生根培养基为MS+NAA 0.4 mg/L+香蕉泥5%+活性炭2 g/L+蔗糖20 g/L，平均生根数达4.8条，平均根长达3.9 cm，不定根分化多而粗壮。生根苗最适宜移栽的基质为腐殖土∶火烧土∶腐熟艾蒿（体积比5∶3∶2）的复合基质，环境条件控制在荫蔽度85%，相对湿度70%～80%，温度22～30℃，移栽成活率可达93.3%。