蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

陈新 徐丽 张力思 魏海蓉 宗晓娟 王甲威 谭钺 朱东姿 洪坡 刘庆忠

摘要：鲨烯合酶基因（SQS）在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用，是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来蓝莓根中克隆得到VcSQS基因，序列全长1489bp，序列分析结果表明，其含有1242bp的开放阅读框，编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高，与山茶科的茶相似性最高，达90.58%，与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明，SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高，芽中的最低。

关键词：蓝莓;角鲨烯合酶基因;同源序列分析;荧光定量

中图分类号：S663.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）05-0001-06

我国蓝莓的种植面积和产量逐年递增，其鲜果多直接食用或加工成一些初级产品果汁、果酱等，缺乏对其高附加值产品的探索。研究表明，蓝莓果实富含多种具有良好保健作用的功能活性物质，果内糖、酸、矿物元素、尼克酸、SOD、黄酮含量非常丰富[1];蓝莓除含黄酮类物质和多酚外，还含有三萜类物质熊果酸和齐墩果酸[2]。

熊果酸（ursolicacid，UA），分子式为C30H48O3，分子量为456.68，是存在于植物中的五环三萜类化合物，具有一定的生物活性和重要的药理作用[2-6]。已有研究证明熊果酸具有抗肿瘤、抗癌、保肝、消炎等多种功效，能够抵抗多种致癌及促癌物。张秋萍等[7]认为熊果酸对人白血细胞K562的体外增殖有一定的抑制作用，其抑制效果与所用剂量成正比，并且能够诱导K562细胞的凋亡。Kassi等[8]证明熊果酸可明显抑制前列腺癌细胞PC-3和LNCaP。此外，熊果酸中含有脂羟基化学结构，抗氧化能力强，能够清除自由基，具有美白护肤的功效，多用于化妆品添加物。由于其特殊的药理作用，熊果酸被推崇为最具潜力的抗癌药物之一。另有研究发现熊果酸对化学药品引起的肝损伤拥有比齐敦果酸更好的疗效[9]。因此，蓝莓三萜类物质的研究对于癌症等疾病的治疗具有深远意义。

三萜类化学物质的合成主要依赖的合成途径是类异戊二烯代谢途径[10]。鲨烯合酶分布于内质网，两分子的法尼基焦磷酸在该酶的催化下，生成一分子的鲨烯[11]，而鲨烯是三萜类化合物的第一个前提物质[12]。所以，对控制鲨烯合酶合成的基因SQS的研究显得尤其重要，有助于我们在分子水平上利用基因工程的手段实现三萜皂苷的规模化生产。

大多数植物的SQS以基因家族的形式存在，其在不同物种中除成员数量不同，表达量也存在差异[13，14]。研究者在拟南芥中发现6种SQS基因异构型，能够编码1～3种有功能的鲨烯合酶，另外的4～6种没有催化活性[15];在所有组织中SQS1异构型均有表达，而SQS2不同，主要在叶脉中表达[16]。人参有3个异构型的基因，都可催化角鲨烯的合成[10];北柴胡有2个SQS基因的氨基酸同源序列相似性达到96%[17]。由此可以看出，同一物种不同异构型的SQS基因所表达的蛋白质氨基酸序列相对保守。现已克隆出多种植物的SQS基因，并在分子水平上对植物体内的三萜类物质的代谢做了深入研究。

本研究利用RT-PCR技术从蓝莓中克隆到VcSQS基因，并与其它物种的SQS氨基酸序列进行同源对比，同时分析该基因在不同组织中的表达水平，以期探明鲨烯合酶在不同物种间的保守性及进化关系，并为进一步探究SQS基因表达与三萜皂苷类含量的关系奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料‘喜来蓝莓根取自山东省果树研究所泰东苗圃。取材后用液氮速冻，于-80℃保存备用。

1.2总RNA的提取及cDNA的合成

利用TaKaRaMiniBESTPlantRNA提取试剂盒提取蓝莓根RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带的完整性。将提取后的RNA参照abmgood|5XAll-In-OneRTMasterMix反转录试剂盒说明书步骤进行反转录，将反转录得到的cDNA-20℃保存备用。

1.3VcSQS基因的克隆

根据已知其它植物SQS基因设计特异性引物（表1），以cDNA为模板，扩增目的片段VcSQS。PCR反应体系为20μL：模板0.5μL，上下游引物F、R各0.6μL，dNTP1.6μL，TaqDNAPoly-merase0.1μL，5×Buffer4μL，补水至终体积20μL。反应程序：94℃预变性3min;98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，35个循环;72℃延伸5min。利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，拍照并记录试验结果。使用OMEGA公司的凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，将纯化得到的目的片段连接到克隆载体pTOPO-Blunt上，转化、筛菌后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，验证全长序列的准确性。

1.4生物信息学分析

将序列通过NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行Blast比对分析，搜索并下载其它物种的序列。利用DNAMAN软件进行不同物种间氨基酸序列同源性分析，利用MEGA7.0构建系统进化树。

1.5VcSQS基因组织表达特性

所用VcSQS基因qRT-PCR的引物（表1）由通用生物公司合成。利用DBI公司的SYBRGREEN進行qRT-PCR。反应体系为20μL：模板为2μL，正反向引物各0.5μL，mix10μL，ddH2O7μL。利用ABI7500荧光定量仪采用两步法进行荧光定量PCR扩增。反应程序：95℃120s，95℃10s，60℃30s，循环40次后进行熔解曲线分析。每样品重复3次，采用2-ΔΔct的计算方法分析相对表达量。以蓝莓青果的表达量为对照。

2结果与分析

2.1VcSQScDNA的克隆分析

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，扩增条带大小为1500bp左右，与预期一致，可初步判断得到VcSQS基因。使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，再次电泳，得到与PCR产物大小一致的条带（图2）。

2.2VcSQS基因的获得及序列分析

利用RT-PCR和RACE技术从蓝莓根中成功克隆VcSQS基因，序列全长为1489bp。其含有1242bp的开放阅读框，共编码413个氨基酸（图3）。

2.3蓝莓VcSQS的同源序列分析

利用DNAMAN软件对推导的蓝莓VcSQS氨基酸序列与其它物种进行同源性分析，结果（图4）显示，其与甘蓝、荠蓝、水稻、蓖麻的同源性在70%～80%之间;与甘蓝的同源性最低，为70.79%;与另外10种植物的同源性都在80%以上，与茶的同源性达到90.58%。总体而言，蓝莓与所参考的14种植物SQS蛋白的氨基酸序列相似性较高。

2.4蓝莓VcSQS的系统进化分析

为了更加清晰地看出蓝莓VcSQS与其它植物SQS之间的进化关系，利用MEGA7.0软件，在多重比较的基础上，将包括蓝莓在内的15种植物的SQS蛋白氨基酸序列构建系统进化树（图5）。蓝莓SQS与山茶科植物茶为一个类群，亲缘关系最近，与葡萄的亲缘关系也较近;与其它种属植物的亲缘关系稍远，这与氨基酸序列同源性结果一致。这表明SQS基因具有种属特异性。

2.5蓝莓VcSQS基因在不同组织相对表达量分析

本试验分别提取蓝莓的青果、紫果、花、叶、芽、根的总RNA，反转录得到cDNA，进行荧光定量分析。由图6可以看出，蓝莓不同组织中VcSQS基因相对表达量的高低依次为叶、青果、根、花、紫果、芽。

3讨论与结论

三萜类化合物具有良好的药用价值和经济价值，对其有关次生代谢产物合成的基因调控研究现已发展成为热点领域。角鲨烯合酶SQS在三萜类化合物合成途径中发挥重要作用，是上游代谢通路中的一个关键酶。目前，关于角鲨烯合酶的研究多集中于药用植物人参、刺五加等，对蓝莓的SQS研究较少。本研究以‘喜来蓝莓品种为试材，从根中成功克隆VcSQS基因，序列分析表明，VcSQS基因含有1242bp的开放阅读框，编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，蓝莓与山茶科的茶相似性最高，达90.58%，与葡萄相似性达87.92%。系统进化树表明蓝莓SQS与山茶科植物茶亲缘关系最近，为一个类群，与葡萄的亲缘关系也较近，同源序列比对结果和系统进化树得到的结论一致。荧光定量检测结果表明，VcSQS基因在蓝莓的果实、花、叶、芽、根组织器官中均有表达，叶中的表达量最高，芽中的表达量最低，青果中的表达量高于紫果。邢朝斌等[18]对刺五加角鲨烯合酶基因的研究表明SQS在叶片中的表达量要高于根。这与本研究中得出的叶中高于根中的结果一致。由此证明很有可能对于不同的物种来说叶中SQS基因表达量相对较高。但对于利用基因工程技术使SQS基因在指定组织中得到高效异源表达，进而提高三萜类物质的合成，仍需进一步探究。

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