猪蛔虫微管蛋白α-链基因（13E09）在不同发育期的mRNA表达研究

吴金妃 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

猪蛔虫病是由寄生于猪小肠的猪蛔虫引起的一种线虫病，呈是世界性流行，不管是集约性养殖场还是散养户都广泛存在，3～6月龄的仔猪最易感，当猪感染后，不仅会生产发育不良，甚至可引起死亡[1]。所以说猪蛔虫病是一种危害我国养猪业极为严重的寄生虫病。

猪蛔虫幼虫和成虫不同发育阶段引起的症状和病变是各不相同的。幼虫主要对肝脏和肺脏造成病变，而成虫则是对胃肠道造成影响，有的蛔虫还可进人胆管，造成胆管堵塞，引起黄疸等症状；另外成虫能分泌毒素，作用于中枢神经和血管，引起一系列神经症状。成虫夺取宿主大量的营养，使仔猪发育不良，生长受阻，被毛粗乱，常是造成“僵猪”的一个重要原因，严重者可导致死亡[1]。

鉴于蛔虫简单的生活史（直接发育），且繁殖能力强[2]，再加上虫卵对各种外界环境的抵抗力强，以至于猪蛔虫病的广泛流行。目前对该病的研究主要围绕药物治疗和预防两方面。例如，Ho N F H等[3]应用活体蛔虫和选择性放射性标记研究了表皮吸收药物后的组织分布及药动学，以及抗蠕虫药的研发等等诸如此类对药物的研究有许多，也取得了喜人成绩，研制出了各种各样的药物，但由于长期或滥用药物，蛔虫的耐药性与药物的残留等问题也随之而来。因此，以研究基因功能为目的的免疫防治成为新的研究方向之一[4-7]。本实验以β-actin基因为内参，采用半定量RT-PCR技术研究猪蛔虫不同发育阶段微管蛋白α-链基因（13E09）的表达丰度，为进一步了解猪蛔虫的发育提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 猪蛔虫不同发育阶段虫体的总RNA，由福建龙岩学院寄生虫学实验室提供。

1.2 主要试剂和设备 由TOYOBO公司提供的ReverTra Ace-a-TM试剂盒、由美国Bio-RAD公司生产的PCR仪和Bio-RAD电泳系统、由英国UVTTEC公司生产的凝胶图像分析系统、由法国吉尔森公司生产的微量取液器 （2 μL、200 μL、1 000 μL）、由北京六一仪器厂生产的电泳仪（DYCP-31BN）、由美国Forma公司生产的Thermo Forma低温冰箱。

1.3 试验方案

1.3.1 逆转录反应 主要参照ReverTra Ace-a-TM试剂盒说明书进行，并进行一定的优化，反应体系见图 1。 反应条件为：30 ℃、10 min；42 ℃、40 min；99 ℃、5 min；4 ℃、5 min。

图1 逆转录反应体系

1.3.2 内参β-actin基因的PCR扩增反应 选取β-actin作为本次试验的内参基因，反应步骤和条件参考邓艳（2006版）[8]并根据需要做适当优化。此次引物合成由上海生物工程有限公司完成。引物模板见图2，反应体系见图3。反应条件为：94℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环；72℃后延伸10 min。

图2 引物模板

1.3.3 PCR扩增

1.3.3.1 引物设计 使用已知的微管蛋白α-链基因（13E09）序列（基因登录号：ES291007）作为本次目的基因引物的设计模板，通过primer的自动搜索功能和oligo软件对目的引物进行筛选比对、分析和设计。该引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：上游引物5'TTCCTTCGGCAGATGTCA 3'；下游引物5'GCTTCCTGGTCTTTCACTCA 3。用DEPC水将合成的引物稀释成10 pmol/uL的使用浓度，然后分装保存（-20℃）待用。

1.3.3.2 Mg2+浓度优化 分别采用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L的Mg2+浓度进行引物 PCR扩增反应，其余条件一致。PCR反应完成后，各取5 uL扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳分析。最后根据目的条带的亮度和特异性来确定Mg2+的最佳浓度。Mg2+优化PCR体系见图4。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s， 引物退火 30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃后延伸10 min。

1.3.3.3 退火温度的优化 PCR扩增按照PCR程序设定的退火梯度进行，利用琼脂糖凝胶电泳对5 μL PCR扩增产物进行分析，根据其亮度和特异性确定合适的退火温度。PCR扩增条件与1.3.3.2相同。

图3 内参β-actin基因的PCR扩增反应体系

1.3.3.4 循环数的优化 分别以 26、28、30、32、34、36次作为反应体系的循环数，利用琼脂糖凝胶电泳系统对5 μL PCR扩增产物进行分析。用Quantity One软件测量电泳条带的光密度，选择线性范围内的循环数，且选择目的条带最亮的次数作为最佳次数。PCR反应体系同上，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，引物退火 30 s，72℃延伸30 s，分别按6个设定的循环数进行试验优化；72℃后延伸10 min。

图4 Mg2+优化PCR体系

1.3.4 不同发育阶段猪蛔虫感染期幼虫差异基因的表达分析 通过以上实验的优化结果，各参数均选取最优，进行PCR反应，从而研究不同发育阶段幼虫差异基因的表达情况。不同发育阶段幼虫差异基因的扩增均在同一PCR反应体系中进行，然后进行琼脂糖凝胶电泳，最后用Quantity One软件测量各目的电泳条带的光密度值备用。目的基因的mRNA的含量用目的基因和内参基因β-actin的积分光密度的比值来表示。

1.3.5 RT-PCR产物测序分析 将以上试验所产生的RT-PCR产物送到上海生物工程有限公司进行测序，并且将测序出来的结果和已知的EST片段进行比较分析。

2 结果和分析

2.1 内参基因扩增结果 扩增结果见图5。根据Quantity One软件对电泳条带进行光密度测定，得出β-actin的光密度值。结果雌虫为17.24，雄虫15.65，虫卵 13.00，肺 L3 为 12.85，肠 L4 为 17.81，感染期幼虫为19.97，用Excel软件做统计学分析，结果显示，内参β-actin基因光密度值在不同发育期差异不显著（P=0.224>0.05），说明该基因在猪蛔虫内稳定表达。

2.2 Mg2+浓度优化结果 Mg2+离子浓度对PCR的扩增有很大的影响，高浓度会降低PCR扩增的特异性，而低浓度则会影响PCR扩增的产率，甚至会导致PCR扩增失败而没有扩增条带[9]，根据Mg2+浓度的优化电泳结果分析（见图6），该基因的最佳Mg2+浓度为1.5 mM。

图5 β-actin基因在猪蛔虫不同发育期的PCR产物电泳图

图6 不同Mg2+浓度PCR产物电泳图

2.3 退火温度的优化结果 在PCR扩增过程中，退火温度是影响PCR特异性较重要的因素，设定的退火温度要低到足以保证引物与目标基因的有效退火，高到足以减少非特异性结合。根据图7的退火温度优化电泳结果分析，该目的基因的最佳退火温度为48℃。

图7 不同退火温度PCR产物电泳图

2.4 循环数对PCR产物光密度值的影响 根据电泳结果显示，13E09基因在32循环数内扩增在指数增长期。试验中13E09基因采用33循环数进行试验。循环数优化结果见图8-图9。

2.5 以β-actin基因为内参，对目的基因（13E09）在不同发育期的半定量RT-PCR结果

2.5.1 电泳分析 利用琼脂糖凝胶电泳系统对5 μL PCR扩增产物进行分析，用凝胶成像系统拍照，见图10。

2.5.2 光密度和表达情况分析 采用Quantity One软件对每个电泳条带的光密度测量，用各目的基因的积分光密度和内参基因β-actin的积分光密度的比值来代表目的基因在不同发育期的表达量。结果表明，该目的基因除在感染期幼虫呈高丰度表达外，在肠L4期幼虫有多量表达，在雄虫、虫卵期也有少量表达。实验结果见表1和图11。

图8 不同退火循环数下13E09基因PCR产物电泳图

图9 13E09基因不同循环数条带IOD值分析

表1 β-actin和13E09 PCR产物电泳相应条带的IOD值

图10 13E09基因在猪蛔虫不同发育期表达情况的电泳分析

2.6 测序结果分析 将测序所得的序列与已知的目的基因EST序列片段进行比对，两碱基序列100%一致，证明RT-PCR扩增片段是未发生碱基突变的目的片段，测序结果见附件。测序所得序列在GenBank中的非冗余数据库进行blast分析，发现与编码捻转血矛线虫微管蛋白α-链的基因序列有93%的相似性。

图11 猪蛔虫感染期幼虫各目的基因在不同发育期的表达情况分析

3讨 论

RT-PCR方法因其较好的灵敏性和特异性而常被用来检测极少量的反转录产物或者只有少量的样品分析[10]。在大多数的研究中，研究者们关注的是在表达水平上减少或者增加，而非检测少量的变化或者精确的分子数量。因此，尽管随着技术的发展，在精确性上极大的提高了，但半定量RT-PCR仍被广泛的运用。半定量RT-PCR原理是将总RNA逆转录成cDNA，然后扩增目标cDNA和内参cDNA，根据PCR产物量来计算样品中mRNA的相对数量。半定量RT-PCR最关键的是优化最佳的实验条件。近年来，半定量RT-PCR常用来定量测定特异性的mRNA丰度[11-13]。

本实验是在已构建的猪蛔虫感染期幼虫cDNA文库的基础上，采用半定量RT-PCR方法分析13E09基因在5个发育期的表达情况，结果显示，该基因除了在感染期幼虫呈高丰度表达外，在肠L4幼虫也有多量表达，在雄虫、虫卵期也也有少量表达。

将目的基因在GenBank中的非冗余数据库进行blast分析，发现13E09基因与Caenorhabditis.briggsae编码CBR-MEC-12蛋白的基因和编码捻转血矛线虫微管蛋白α-链（Haemogregarina contortus TubuLin alpha chain）的基因序列有93%的相似性。

从蛔虫的发育史可以看出，感染性虫卵在被宿主食入后，小肠内孵出后开始了一系列的移行经肝、肺后返回小肠[14]。半定量RT-PCR结果显示，13E09基因在感染期幼虫和肠L4中有突出表达，也是表达于幼虫在宿主体内进行一系列移行的时期。已有报道表明微管蛋白个别氨基酸的改变可引起微管蛋白结构的变化，从而导致虫体对以微管为靶点的药物抗性的产生。因此，微管蛋白的研究对猪蛔虫病的免疫预防具有重要意义。