25种无花果种质资源SSR分析

(唐山师范学院生命科学系，河北 唐山 063000)

无花果(FicuscaricaL.)又名奶浆果、映日果、蜜果等，隶属桑科(Moraceae)榕属(FicusL.)植物，多为落叶乔木或灌木[1]，原产于地中海沿岸，唐代开始引入我国栽培，目前主要分布于新疆、山东、江苏、上海等地区[2-3]。由于无花果主要以扦插、分株等无性繁殖为主，20世纪90年代以来又从国外引入一些新品种，从而造成品种间混淆、品种之间亲缘关系不清楚，依靠过去的从形态上进行品种区分，已经很难做出准确的判断[3]。用分子标记的方法对无花果进行种质资源鉴定前人已有研究，如王亮等对山东省的无花果种质资源进行了RAPD分析[4]，郭正兵采用SSR荧光标记毛细管电泳法分析了30份无花果品种的遗传多样性[3]。由于我国无花果品种近千种，具有推广价值的近100种，因此对无花果品种之间的亲缘关系鉴定还是一项重要的课题。

SSR(simple sequence repeats,SSR)也称微卫星DNA，SSR分子标记技术是近年发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，是一种在基因组内广泛分布的高多态性标记，拥有共显性和可重复性等优点[5]，广泛应用于品种鉴定[6]、系统发育关系研究[7]、遗传多样性研究[8-10]、遗传连锁图谱的构建[11]和分子标记辅助育种[12]等领域。本文运用SSR分子标记技术，对来自河北省农林科学院滨海农业研究所在国内搜集的25种无花果种质资源进行了遗传多样性方面的初步研究，25个无花果品种主要来源于美国、日本、法国、意大利等国家，其中7个品种(青皮、A 1213、布兰瑞克、以色列、紫陶芬、金傲芬、玛斯义陶芬)的亲缘关系在郭正兵等[3]的研究中已有报道，本试验进一步对25种无花果种质资源进行亲缘关系鉴定，旨在了解其资源的分布与演化程度，为无花果资源保存与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用25种无花果：砂糖、焦黑、日黑、圣果、维尼、红果、蓬莱柿、芭劳奈、青皮、白亚、土耳其、夫人、西莱、法紫、美味华丽、A 1213、龙波、布兰瑞克、以色列、紫陶芬、皮特、金傲芬、拉鲁高、玛斯义陶芬、红矮生(从左到右依次编号为1～25)。由河北省农林科学院滨海农业研究所提供。

1.2 试剂和仪器

1.2.1试 剂

异丙醇、氯仿、无水乙醇、DNA快速提取试剂盒均购自上海生物工程股份有限公司(上海)。SSR-PCR扩增所用的2×Taq PCR Mastermix购自北京天根生化科技有限公司。

1.2.2仪 器

大型冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、96孔PCR仪(Applied biosystems)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取

利用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，试剂盒主要成分为CTAB。

1.3.2SSR引物

20对引物选取参考郭正兵等[3]的报道，委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行合成，引物名称和序列见表1。

1.3.3PCR扩增

SSR-PCR扩增体系(20μL)：DNA模版2μL，上游引物0.8μL(100μmol·L-1)，下游引物0.8μL(100μmol·L-1)，2×Taq PCR Mastermix 10μL，ddH2O 6.4μL。SSR-PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，45～55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[14]。

1.3.4SSR-PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶检测

SSR-PCR扩增结束后，取扩增产物5μL，在8%的聚丙烯酰胺凝胶中检测，然后银染法显色，拍照并记录结果。

1.4 数据处理

将电泳图谱清晰且可重复的条带赋值为1，同一位置上未出现条带的赋值为0，形成1，0数据矩阵，用DPS软件进行数据分析，得到遗传距离，用UPGMA(非加权组平均法)进行聚类分析。

表1 SSR分析所用引物编号和序列[3]

引物编号序列(5’-3’)FCUP038-6FCAATGTATCATTTCATCTCACGAAFCUP038-6RAGTTCCCATGTTTGGTTACTGAFCUP044-6FGCTCGCCTTTCTAACATGGAFCUP044-6RAACTTTCATTCATTGCGGAAAFCUP045-6FTTCCAAGGCATATTATGTTGAAAFCUP045-6RGTCCAAGGCAAATGATGAAFCUP066-7FCCCTCTCGAAGAAGAAGCAFCUP066-7RCTACAGGAAATGGGCCTCAAFCUP069-6FCCGGAAACACACAAATTCAAFCUP069-6RCAAAGCGTCGACTCACTGAAMFC2FGCTTCCGATGCTGCTCTTAMFC2RTCGGAGACTTTTGTTCAATMFC7FCACAATCAAAATAGTTACCGMFC7RAGCGAAGACAGTTACAAAGCMFC8FGTGGCGTCGTCTCTAATAATMFC8RTATTCTATGCTGTCTTATGTCALMFC17FTTAAGAATACGTCCTTGGTATLMFC17RGAGATTTCGTTGACTTCATTLMFC19FCTTATGAAAACTCGGTAGAAGLMFC19RAATGAATGGAAATGATCTTGLMFC27FATTTCTTCAACTTTTGTAATGALMFC27RCCTTTTGTCTACATATACCTTTLMFC28FTGATTCCTTTTACTTGTAGATTLMFC28RAAGACATTGAGACATACCAGLMFC30FTTGTCCGTTTCTTATACAATLMFC30RTCTTTTTAGGCAGATGTTAGLMFC37FAAGTACATCTTCACCATTGALMFC37RATTAAACTCTTCATTCATCAGTLMFC38FCTCAACGTCCGTACTAACTALMFC38RCTAAGGAATAAAAGGAGAAAAMFC1FACTAGACTGAAAAAACATTGCMFC1RTGAGATTGAAAGGAAACGAGMFC3FGATATTTTCATGTTTAGTTTGMFC3RGAGGATAGACCAACAACAACMFC4FCCAAACTTTTAGATACAACTTMFC4RTTTCTCAACATATTAACAGGMFC5FACCAATCCAAATAATAATCCMFC5RACACGCTTACTAGAATTACCMFC6FAGGCTACTTCAGTGCTACAMFC6RGCCATAAGTAATAAAAACC

2 结果与分析

2.1 25种无花果基因组DNA提取

将提取出来的25种无花果基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明，25种无花果样品的基因组DNA条带清晰，基本无弥散(图1)，说明所提取DNA质量较好，纯度可靠可用于进一步的分析。

图1 无花果基因组DNA图谱

图3 引物LMFC 38 F/38 R对25种无花果的扩增结果

2.2 SSR引物对25种无花果的扩增

用20对引物在25种无花果样品中共扩增出95条带，其中多态性带83条，多态性比率为87.37%，平均每对引物扩增出4.75个多态性条带，引物MFC 2 F/2 R扩增条带数最多，共扩增出10条带，其中多态性条带为8，引物FC 19 F/19 R只扩增1条多态性条带，条带数最少(表2)。

表2 20对SSR引物在25种无花果材料中的扩增结果及多态性分析

引物扩增条带数多态性条带数多态性条带比例/%FCUP038-6F/R8787.50FCUP044-6F/R5480.00FCUP045-6F/R5360.00FCUP066-7F/R77100.00FCUP069-6F/R22100.00MFC2F/R10880.00MFC7F/R88100.00MFC8F/R2150.00LMFC17F/R33100.00LMFC19F/R11100.00LMFC27F/R55100.00LMFC28F/R22100.00LMFC30F/R33100.00LMFC37F/R5480.00LMFC38F/R22100.00MFC1F/R44100.00MFC3F/R4125.00MFC4F/R55100.00MFC5F/R6583.33MFC6F/R88100.00合计958387.37

注：多态性条带比例=多态性条带数/扩增条带数。

2.3 25种无花果材料的遗传距离分析

利用20对SSR引物在25种无花果样品中扩增到的95条带计算样品间的遗传距离，由表3可见，25个无花果样品间的遗传距离在0.20～1.00之间，其中以色列和马斯义陶芬遗传距离最小，为0.20，亲缘关系最近；西莱和维尼、蓬莱柿、美味华丽、布兰瑞克、金傲芬、马斯义陶芬这6个品种的遗传距离均为1，遗传距离最大，亲缘关系最远。

2.4 25种无花果的聚类分析

20对SSR引物的扩增结果采用UPGMA法进行聚类分析，从图2可看出，25种无花果样品都聚在遗传距离为0.20～1.00类群中。在遗传距离为0.77处，可将供试的25种无花果分为3大类，第1大类仅包括西莱这一品种，第2大类包括砂糖、日黑、法紫、美味华丽，其他品种归为第3大类。

图2 25种无花果样品SSR分析的聚类图

2.5 SSR分子标记进行种质资源鉴定

电泳结果中的特异性条带，可作为一种分子标记来进行品种鉴定。本实验中，引物对LMFC 38 F/38 R在大约200 bp的条带可作为鉴定23号无花果的分子标记(图3)，而引物对MFC 1 F/1 R在100-250 bp条带可鉴定出19号无花果(图4)。

表3 基于SSR引物计算的25种无花果样品的遗传距离

No.12345678910111213141516171819202122232420.68830.6670.76540.6670.5710.66750.6900.4210.7330.51660.7940.3850.8290.4690.40570.7780.3080.7780.6320.3680.41580.7950.3570.8540.6250.4880.3000.26890.6820.4550.7390.4580.6570.4850.5680.600100.5710.4710.7500.5390.5460.5430.5410.5000.607110.7500.4500.8240.5000.4320.3060.4760.3250.5150.438120.7830.5290.7270.5600.6470.7110.5950.6250.6300.6430.588130.9090.9700.9090.9471.0000.9691.0000.9740.9500.9520.9680.947140.7650.7350.6000.6820.7810.8000.7840.8000.7500.7600.7940.5500.818150.7690.8490.6670.8570.8280.9120.8570.9250.8640.9170.9410.8001.0000.692160.7080.4860.6520.4400.6000.5950.5140.6190.5190.5360.5830.4400.9550.5460.714170.7220.2560.7900.5790.4000.4050.3330.3410.5530.5260.3500.5000.9730.7300.8330.460180.8110.4650.7780.5950.4500.4150.4190.4220.5280.6150.4000.6671.0000.7840.8890.6250.372190.7140.4050.8460.7070.5000.4650.3570.2860.5790.6250.4520.6410.9720.7900.8610.6000.3490.467200.7740.4620.8130.5630.4870.4050.5240.4880.5760.6290.3430.6060.9660.7810.8670.5590.3160.4880.385210.6880.3590.8000.5710.3330.3420.4290.4320.5830.5140.3680.6840.9700.7710.8490.5680.3000.4290.3660.235220.8110.3900.8420.6670.4880.4150.3810.3860.6050.7140.4390.6671.0000.8160.8570.5900.2930.3420.3170.2780.350230.8250.4670.8540.6590.5230.4890.3860.4260.5640.6100.4770.6590.9740.8290.8970.5500.3780.4220.4350.4520.4670.386240.7750.4570.8860.6430.4770.3720.3780.2730.5500.5610.3950.6740.9750.8100.9020.6050.3330.3780.1950.4050.3490.3410.311250.7590.5500.7590.5810.4570.4600.5000.5680.5940.6470.4440.6671.0000.7240.8150.5310.4500.4210.4750.3640.3430.3780.5350.452

图4 引物MFC 1 F/1 R对25种无花果的扩增结果

3 讨 论

无花果的分类大多依据叶形、果皮颜色、果形大小等进行分类，经常会发生品种资源的混淆，导致同种异名或异种同名，因此，有必要采用分子鉴定方法对其进行进一步的鉴定。SSR技术作为常用的一种分子标记，能进行种质资源和遗传多样性的分析。国外已有许多学者利用SSR分子标记对无花果种质资源进行遗传多样性分析。如Perez-Jiménez等[13]利用21对SSR引物对西班牙南部的42种无花果进行了遗传多样性分析，通过聚类分析将其分成3大类，同时证明了分子标记技术在物种遗传关系的分析具有重要作用。Essid等[14]利用13对SSR引物对20种突尼斯野生无花果进行遗传多样性分析，表明不同地理区域的无花果遗传多样性较窄。郭正兵等利用SSR荧光标记毛细管分析法对30份无花果资源进行了遗传多样性的鉴定，通过聚类分析在0.77处将其分成2大类，并且得出金傲芬与A 1213间的亲缘关系较近，紫陶芬，青皮亲缘关系密切，布兰瑞克和玛斯义陶芬亲缘关系较近聚集在0.40以下[3]。结果表明，25种无花果种质资源的遗传距离在0.20～1.00之间，平均为0.60，布兰瑞克和玛斯义陶芬被聚为一类；A 1213和青皮被聚在一起，亲缘关系较强。与郭正兵等[3]的聚类分析结果相似。而以色列和马斯义陶芬遗传距离最小为0.20，亲缘关系最近。马斯义陶芬原产美国加州，从日本引入我国，属于红色大果型无花果品种而以色列果实黄绿色，二者果实颜色、大小等形态学差异较大却表现出非常近的亲缘关系，这与郭正兵等[3]的实验结果稍有不同。总之，25种无花果中大多数品种遗传距离为0.58以下，说明25种无花果种质资源遗传多样性较窄，这可能是由于无花果长期采用无性繁殖的方式进行，导致无花果种质间的演化速度较低的缘故。本实验室同时进行了25种无花果种质资源的RAPD分析和ISSR分析。RAPD分析和ISSR分析将25种无花果种质资源分成2大类，并且这2种分析结果相似都是把布兰瑞克单独聚为一类，聚类结果与本试验不太一致，可能是不同的分析方法稍有不同导致的结果。

SSR分子标记技术在对植物进行植资源进行鉴定方面也得到了广泛应用。王庆彪等[15]利用SSR分子标记筛选获得20对核心引物，用于构建中国50个甘蓝代表品种DNA指纹数据库，通过构建人工模拟群体对‘中甘21’品种的真实性进行鉴定，准确率达100%。苑克俊等[16]利用6个荧光SSR分子标记研究15份杏种质，建立15份杏种质的分子身份证，成功区分4个杏新品系，为4个杏新品系利用分子鉴定进行品种权保护提供依据。前人已经采用了RAPD，SSR等分子标记技术对无花果进行了鉴定，如王亮等[17]利用SSR和RAPD技术对11种无花果进行了DNA分析，为品种鉴定提供了分子水平上的依据。本实验采用的是SSR技术对无花果进行种质资源鉴定。20种引物对不同地区的25个无花果品种进行SSR分析，结果表明SSR可以作为一种分子标记来进行品种的鉴定，如：MFC 1 F/1 R引物对可鉴定出19号；LMFC 38 F/38 R引物对可鉴定出23号。无花果SSR分子标记的建立为构建无花果DNA指纹图谱进行分子水平的鉴定奠定了基础。