PCR联合HPV检测在宫颈癌筛查中的应用

姚千红　徐舜　赵倩倩

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年4月～2018年4月我院收治的宫颈癌患者86例，纳入标准：（1）经医院初步检查确诊为宫颈癌且基本生命体征平稳者;（2）具有详细且完善的临床治疗资料者;（3）之前未接受过外科手术切除治疗者。排除标准：（1）患有精神疾病不能配合本研究者;（2）同时并发其他系统的严重疾病者。在回顾性总结我院对这86例患者的检查方法的基础上，依据是否在接受荧光PCR法进行检测筛查的基础上联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定筛查法，将其分为两组。对照组患者接受荧光PCR法进行检测筛查，研究组患者在应用荧光PCR法的基础上联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定进行筛查。其中对照组43例，怀孕次数0～4次，平均（2.39±0.7）次;研究组43例，患者产次0～2次，平均（2.19±0.8）次，年龄20～50岁，平均（21.2±2.4）岁。患者均知情同意本研究，两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

对照组：采用常规的荧光PCR法进行检测筛查。第一，对待测基因进行PCR;第二，电泳PCR结果;第三，分析结果：若无特定的扩增片断出现，说明该诊断基因缺失;若扩增片断的大小与正常基因不同，说明发生了突变。另外，对PCR扩增片段直接测序，可以诊断未知突变基因核苷酸的改变。使用荧光PCR仪对其GAPDH含量进行检测，R：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，F：5'-GAAGGTGAAGGTCGGA-GTC-3'是引物;5'-fam-CAAGCT TCCCGTTCTCAG-CC-tamara-3'是针序列;210 bp是产物。反应中含有模板（5 μL）、6 pmol探针、10 pmol引物、10 pmol Taq酶1.5 U、3.5 mmol MgCl2、200 μmol dNTPs以及10×buffer（2.5 μL），总体积为25 μL。反应条件：在94℃下进行10 min的预变性，94℃下进行30 s的变性，62℃下进行60 s的延伸和退火，共43个循环。

研究组：在应用荧光PCR法的基础上联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定进行筛查，具体检测步骤：（1）收集患者的宫颈细胞样本，首先暴露患者的宫颈，在过程中采用引导窥阴器，采用取样器采集患者的宫颈脱落细胞。（2）样本筛查：将采集的患者宫颈脱落细胞放入无菌管中，制备带荧光的人乳头瘤病毒分型单链核酸作为探针，通过PCR法扩增该探针分子，主要包括变性、复性及延伸三步，之后在分子水平上进行样本的篩查;（3）如样本检测呈现阳性或有明显的症状出现，要进行相关的细胞学检测;在无菌管中倒入保存液，静置，除去上清液，进行离心，把样本烘干染色后进行观察;（4）进一步行阴道镜检查，充分结合患者的阴道的检查结果，如患者病情严重则可以采取宫颈活检检查，以液基细胞学及病理诊断结果为金标准进行对比，具体方法嘱患者于月经过后的3～7 d来院行电子阴道镜检查。首先选用被3%醋酸浸泡过的棉球，涂抹宫颈表面约30 s。然后将棉球取出，约2 min后，对宫颈表面行冷光源照射。当宫颈表面由白色变为半透明白色、再变到稍暗白色、直至污浊灰白，而病变边缘经过模糊-锐利-卷曲的变化。血管经历由细小均一的点状血管变为镶嵌至厚的醋酸白上皮表面缺乏血管，最后为粗大点状血管。以上述结果作为评判依据，进行阴道镜下子宫颈癌的筛查。

1.3 观察指标

采用通用的Bethesda 系统（the Bethesda system，TBS）分级系统进行细胞学诊断，结果为性质未定的不典型鳞状细胞（atypical squamous cells ofundetermined significance，ASCUS）及以上判断为阳性。对于活检及LEEP 环切术组织，参考WHO（2003）《乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学和遗传学分类》，CINⅠ及以上判断为阳性。把LEEP 术后组织病理学诊断作为“金标准”，TCT 筛查结果和阴道镜下多点活检病理诊断与LEEP 病理诊断在同级别之内认为符合，不在同一级别判为不符合。对接受检查的两组患者进行密切的观察研究并统计所有患者的高危型人乳头瘤病毒感染率，并对处在不同年龄段的患者出现的感染情况进行进一步的分析统计，计算感染率，将两组患者进行比较，分析对不同的宫颈病变发生高危型人乳头瘤病毒感染的几率，感染率=（感染例数/总例数）×100%。

1.4统计学方法

应用SPSS18.0统计学软件分析处理，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同年龄阶段高危型人乳头瘤病毒感染的情况

在接受检测的86例患者中，有65例患者出现高危型人乳头瘤病毒感染，总体的感染率75.6%;20～29岁患者的感染率为80.0%，30～39岁患者的感染率为66.7%，40～49 岁患者的感染率为82.1%，50～59岁患者的感染率为73.7%。不同年龄阶段高危型人乳头瘤病毒感染的情况不同（P<0.05）。见表1。

2.2两组患者高危型人乳头瘤病毒感染率比较

研究组检测出的高危型人乳头瘤病毒感染率高于对照组（P<0.05）。见表2。

3讨论

在临床医学中，女性发生宫颈癌的原因多种多样，由很多的因素造成，如感染或其日常生活习惯不好、不卫生、性生活紊乱或时间较早甚至是过多的进行性生活，均有可能造成患者的宫颈感染，其中HPV感染引起的宫颈癌病变较为常见[3]。在人的身体机能中，宫颈是位于女性子宫下部较为狭窄的部分，呈现圆柱体的形状，宫颈部阴道处一般分布着鳞状上皮细胞，在宫颈管的内部多呈现上皮细胞，并且宫颈阴道部的鳞状上皮以及上皮可以在宫颈口进行移动[4]。一旦受到刺激或增加损伤，将增加病毒感染的机率，由于病毒入侵而导致宫颈上皮的不正常增生，即为医学上的宫颈癌前发生病变[5]。在临床上宫颈癌前病变如果不及时进行干预，则最终将会引起发展成宫颈癌[6]。所以在临床上最易引起宫颈癌的就是鳞状上皮与柱状上皮进行交接移动的地方[7]。一旦宫颈内部的颈鳞状上皮和柱状上皮受到病毒损伤，让病毒成功入侵，则会感染基底层的细胞，发生上皮细胞的不正常增生，如任其发展则会导致宫颈癌的发生[8]。在临床医学上HPV作为一种环形的病毒，以整合感染及允许感染两种形式存在患者的身体内，大多是在感染后，潜伏在基底的细胞内，进行不断的繁殖增生，一般患者的自身免疫可以清除大部分的入侵病毒[9]。该病毒在患者的身体内会潜伏1～2年的时间，如自身免疫系统在2年内清除不了感染病毒，则会引起宫颈的感染，在这个过程中不进行干预则最终导致宫颈癌的发生[10]。临床上大部分宫颈癌患者均存在HPV 病毒与患者自身基因的整合，一旦HPV病毒与患者自身基因整合将会降低抑癌基因的发展，由此引起细胞的过度增殖，细胞增殖周期出现紊乱，失去正常的控制，细胞核的不正常分裂，将会导致宫颈癌的发生[11]。所以说对于女性患者宫颈癌的筛查检测采用荧光PCR法联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定具有一定的临床意义以及时代的价值[12]。

人乳头瘤病毒（HPV）是一种双链的DNA病毒，这种病毒可以感染皮肤以及体内的上皮细胞，将导致患者体内产生增殖病变的细胞及乳头瘤样改变[13]。人乳头瘤病毒普遍存在于人类的生活环境中，具有高度的组织性以及特异性，一旦感染将会引起患者细胞进行不正常的增殖，产生宫颈感染[14]。在现代的医学发展中，分别根据DNA基因的不同已经产生近200种的人乳头瘤病毒，其中约有1/4的类型可以对人类的生殖道进行感染[15]。人乳头瘤病毒还可以根据对人类的感染力度分为低危型以及高危型两种[16]。在临床上对人乳头瘤病毒检测较为敏感的方法是荧光PCR 技术进行筛查检测，但是检出率相对于荧光PCR法联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定低，本研究表明，在接受检测的86例患者中，有65例患者出现高危型人乳头瘤病毒感染，总体的感染率75.6%;20～29岁患者的感染率为80.0%，30～39岁患者的感染率为66.7%，40～49岁患者的感染率为82.1%，50～59岁患者的感染率为73.7%。不同年龄阶段高危型人乳头瘤病毒感染的情况不同（P<0.05）;研究组检测出的高危型人乳头瘤病毒感染率高于对照组（P<0.05）。研究发现，采用荧光PCR法联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定对宫颈癌癌前病变的筛查较为准确，在临床上有较高的参照价值。

综上所述，荧光PCR法联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定在宫颈癌癌前病变筛查中有着非常重要的作用以及对于医学检测具有指导作用，检出率更高，效果理想，临床上应进一步推广应用。

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（收稿日期：2018-10-28）