血脂异常患者ApoE基因型对他汀类药物降脂疗效的影响

何思颖，杜鹏辉，张 磊，杨 娜，郑 芳△

(1.武汉大学中南医院基因诊断中心,湖北武汉 430071；2.武汉大学中南医院检验科,湖北武汉 430071；3.中国地质大学(武汉)医院，湖北武汉 430071)

血脂水平过高可引起一系列严重疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、慢性肾功能衰竭等[1-2]。目前常见降脂药主要有他汀类、叶酸类以及抗氧化剂类等[3-5]，其中他汀类药物应用广泛。他汀类为3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的选择性抑制剂，能减少内源性胆固醇的合成，同时反馈刺激肝细胞膜外低密度脂蛋白受体数量增加、活性升高，从而达到降脂目的[6]。

研究表明，ApoE常见基因多态性与他汀类药物降脂疗效相关，e2等位基因携带者使用他汀类药物的降脂效果比其他等位基因携带者更为明显[7]。2017年中国人群的研究表明，ApoE基因型e3/e3的患者经阿托伐他汀治疗后血脂水平的下降程度高于e3/e4型患者[8]。总结现有研究，携带Apoe2的个体降脂效果好于携带Apoe3的个体，携带Apoe4的个体则相反。基于e2和e4等位基因携带不同，将ApoE基因分3个表型组，即E2(e2/e2,e2/e3)、E3(e3/e3,e2/e4)和E4(e3/e4,e4/e4)，国外研究建议按不同表型进行药物敏感型分析[9]，但这种按等位基因携带进行分组的模式在临床应用中适用吗？同时携带e2和e4基因的个体调脂疗效如何？此外，他汀类药物因人种和用药剂量不同[10]，按照ApoE基因表型进行个体化用药在国际上仍存在争议，国外有关他汀类药物分层分析[11]的结果在中国人群中是否适用，仍有待数据验证，特别是吸烟、饮酒等日常生活习惯是否会影响ApoE基因型个体药物的疗效，国内外鲜有报道。

基于上述分析，本文应用Sanger测序技术对ApoE基因进行分型，通过观察血脂变化率，研究ApoE基因多态性对两种他汀类药物疗效的影响，比较吸烟、饮酒对他汀类药物疗效的影响，给临床医师提供精准的个体化治疗方案。

1 资料与方法

1.1一般资料 2016年9月1日至2017年4月30日在武汉大学中南医院使用他汀类药物降脂治疗超过4周的血脂异常患者223例，其中男166例，女57例，平均年龄65岁。血脂异常的纳入标准为：(1)血清总胆固醇(TC)>5.18 mmol/L，(2)三酰甘油(TG)>1.7 mmol/L，(3)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)<1.04 mmol/L，(4)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)>3.63 mmol/L，(5)脂蛋白a[Lp(a)]>300 mg/L，只要满足上述条件中任意一条，即作为血脂异常患者。查询血脂异常患者临床资料，将有他汀类药物用药记录的患者纳入研究，并排除在第1次查脂前已有降脂类药物用药史的患者和联合使用多种降脂药的患者。223例患者平均TC水平为(5.60±0.97)mmol/L，TG水平为(2.83±1.51)mmol/L，HDL-C水平为(1.17±0.32)mmol/L，LDL-C水平为(3.11±0.99)mmol/L，Lp(a)水平为(206.66±217.93)mg/L。

患者应用目前国内临床上使用最为广泛的两种他汀类药物进行治疗，阿托伐他汀用药量20 mg/d(立普妥20 mg*7，辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408)，瑞舒伐他汀用药量10 mg/d(瑞舒伐他汀钙片5 mg*14，IPR Pharmaceuticals，INCORPORATED，国药准字J20170008)，持续用药至少4周。查询患者吸烟饮酒史，根据患者主诉，将吸烟或饮酒长达1年及以上且延续至今，或戒断不足6个月的患者(排除偶尔且极少量吸烟、饮酒者，即每周1～2根的吸烟者及低度数少量，每周1～2次的饮酒者)，编入“吸烟饮酒组”，没有吸烟或饮酒史，或偶尔极少量摄入，或戒断超过半年的患者编入“无吸烟饮酒组”。实验中所有对象均已知情同意。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 ApoE目的片段的扩增使用杭州柏恒科技有限公司的GT9612型基因扩增仪，基因分型采用Sanger测序检测，所用仪器为ABI公司的3730XL DNA测序仪。血脂指标采用奥林巴斯AU5400进行检测。

1.2.2试剂 血液基因组DNA提取试剂盒盒PCR相关试剂为天根生化科技(北京)有限公司产品，PCR所用引物均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。总胆固醇试剂盒(酶法)、三酰甘油试剂盒(GPO-POD法)为贝克曼库尔特实验系统有限公司产品。高、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒(直接法)、脂蛋白a试剂盒(胶乳凝集比浊法)为北京积水医疗科技(中国)有限公司产品。

1.3方法

1.3.1ApoE基因分型 空腹12 h后于次日早晨抽取全血(EDTA-K2抗凝)2 mL，提取全血细胞DNA，对ApoE样基因片段进行PCR扩增，扩增片段长度292 bp，上游引物5′-AAC AAC TGA CCC CGG TGG CG-3′，下游引物5′-ATG GCG CTG AGG CCG CTC GG-3′，PCR扩增反应参数如下：95 ℃ 12 min，94 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 1 min，64.8 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，1个循环。扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行Sanger法测序，223例患者样本均通过测序判断ApoE基因分型情况，依据rs429358(ApoE蛋白112位氨基酸，测序图上70位左右碱基)和rs7412(ApoE蛋白158位氨基酸，测序图上210位左右碱基)的碱基种类不同分6种基因型(图1)：(1)二者均为T纯合：e2/e2；(2)rs429358处T纯合，rs7412处T和C杂合：e2/e3；(3)rs429358处T纯合，rs7412处C纯合：e3/e3；(4)rs429358处T和C杂合，rs7412处C纯合：e3/e4；(5)二者均为C纯合：e4/e4；(6)二者均为T和C杂合：e2/e4。

注：A为rs429358位碱基对T纯合；B为rs429358位碱基对T/C杂合；C为rs429358位碱基对C纯合；D为rs7412位碱基对C纯合；E为rs7412位碱基对T/C杂合；F为rs7412位碱基对T纯合

图1rs429358和rs7412位点测序结果展示

1.3.2血脂指标检测 治疗前和治疗时长≥4周后，空腹12 h于次日早晨采取静脉血，离心取血清，于中南医院检验科检测TC，TG，HDL-C，LDL-C和Lp(a)。

1.3.3血脂变化率 血脂变化率=(用药前血脂指标-用药后血脂指标)/用药前血脂指标。

2 结 果

2.1血脂异常患者的ApoE分型 223例患者中e2/e2占0.4%(1例)，e2/e3占14.8%(33例)，e3/e3占61.4%(137例)，e3/e4占20.6%(46例)，e4/e4占0.9%(2例)，e2/e4占1.8%(4例)。将受试者分为3个表型组E2型(e2/e2和e2/e3型)，E3型(e3/e3和e2/e4型)和E4型(e3/e4和e4/e4型),其所占的百分比分别为15.2%(34例)，63.2%(141例)和21.5%(48例)。

2.2ApoE分型对血脂水平的影响

2.2.1性别和年龄对血脂水平的影响 应用成组t检验比较不同性别和年龄组(以平均年龄为界，<65岁和≥65岁两组)间各血脂变化率指标，其结果差异无统计学意义(P>0.05)。因此可以将不同性别和不同年龄亚组合并研究。

2.2.2E2表型影响他汀类药物的降脂效果 TC、TG、HDL-C和LDL-C的血脂变化率由大到小依次为E2、E3、E4，差异有统计学意义(P<0.05)。E2和E3表型组，E3和E4表型组，E2和E4表型组间两两比较，治疗后的TC和LDL-C水平存在E2E3>E4，差异有统计学意义(P<0.05)。E2型HDL-C的增高变化率较E3、E4型增高明显，差异有统计学意义(P<0.05)，但E3和E4型之间差异则无统计学意义(P>0.05)。他汀类药物调节Lp(a)水平呈E2>E3>E4趋势，但各分型间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3两种他汀类药物的分析 两种他汀类药物调节血脂水平稍有不同，如阿托伐他汀调节TC的能力优于瑞舒伐他汀。E2型和E3型TG水平高者对阿托伐他汀更敏感，E4型TG水平高者对瑞舒伐他汀更敏感。E2和E4型HDL-C水平低者对阿托伐他汀更敏感，E3型HDL-C水平低者对瑞舒伐他汀更敏感，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 不同他汀类药物对各ApoE分型患者

表1 ApoE不同ApoE2，E3，E4表型患者他汀类药物治疗前后血脂变化情况比较(n=223)

续表1 ApoE不同ApoE2，E3，E4表型患者他汀类药物治疗前后血脂变化情况比较(n=223)

2.4吸烟饮酒影响他汀类药物降血脂效果 他汀类药物降低E2表型中吸烟饮酒者TC变化率的效果明显弱于无吸烟饮酒者，差异有统计学意义(P<0.05)。其他二型中吸烟饮酒不利于他汀类药物调节机体TC、TG、HDL-C和LDL-C，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：*表示P<0.05

图3吸烟饮酒状况对不同ApoE分型患者降脂疗效的影响

3 讨 论

他汀类药物在参与血脂调节的过程中，有大量基因编码的蛋白参与调脂，其中ApoE既能和存在于肝脏的低密度脂蛋白受体(LDL-R)和极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)结合，又能和遍及全身组织的脂蛋白结合，可通过多种代谢途径参与机体的脂质代谢，成为影响机体血脂水平的重要内在因素[12]。

ApoE基因DNA链上存在碱基突变，相应的112位和158位氨基酸改变，野生型e3的112位上为精氨酸,158位上为赖氨酸，两种氨基酸的交换决定了异构体的种类[13]。不同等位基因型的ApoE蛋白对极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)的代谢能力不同，其中ApoE4型由于与脂蛋白的结合能力强，代谢快，细胞反馈性减少LDL的摄入，血中LDL-C水平升高[14]，所以可以将6种ApoE基因型的个体基于等位基因的不同而归为3种表型。不同的ApoE表型不仅影响未干预状态下的血脂水平，还影响降脂药物的治疗效果，因此有学者认为应该根据ApoE的基因型选取不同的降脂疗法，而ApoE多态性与药物敏感性的相关分析也成为研究的热点[15]。

本研究引用血脂变化率这一指标，对治疗前血脂水平不同的患者群体进行比较。研究发现，在降低TC、TG和LDL-C水平方面中，E2型对他汀类药物的治疗最为敏感，血脂下降最为显著，E3型次之，E4型的疗效较差，而在降低HDL-C水平方面，E2型仍是对他汀药物敏感性最高的一型，而E3和E4型之间的差异并不明显。TC、TG、LDL-C和HDL-C 4种血脂指标平行比较显示，LDL-C对他汀类药物的敏感性最高，而HDL-C的变化率明显小于TC、TG和LDL-C，说明他汀类药物调节HDL-C的能力较低。在降低Lp(a)方面，表型与药物敏感型之间存在相关趋势，但这种相关性是否存在统计学差异，以及ApoE分型对他汀类药物调节HDL-C的影响仍需扩大数据收集，做进一步分析。

研究发现，他汀类药物种类对不同血脂指标变化率的影响也存在一定差异，3个表型组均显示阿托伐他汀对TC的调节能力优于瑞舒伐他汀。E2型和E3型TG高者对阿托伐他汀更敏感，E4型TG高者对瑞舒伐他汀更敏感。针对E2型和E4型HDL-C低者，阿托伐他汀疗效优于瑞舒伐他汀，而E3型HDL-C低者则相反，但差异均无统计学意义(P>0.05)。各表型受药物不同影响而产生的疗效差异无统计学意义(P>0.05)。但这种药物不同引起的降脂疗效差异与基因分型是否相关，也需要扩大实验数据进一步统计分析。

研究还发现，以吸烟、饮酒为代表的生活习惯同样可对他汀类药物的疗效产生影响。从总体上看，不吸烟、饮酒的生活方式有利于他汀类药物发挥疗效，尤其见于对TC、TG和HDL-C的调节，其中又以TC降低率受吸烟饮酒情况影响最为明显。观察4个血脂指标下3个表型组发现，E2型受吸烟饮酒生活习惯的影响最为显著，而对E4组治疗效果的影响不明显。调节生活习惯有助于药物疗效发挥，这将有利于临床的针对性用药，然而对于这种关系的确认和探索同样需要进一步扩大数据收集。

总结上述研究结果对临床血脂异常患者提出他汀类药物用药建议：(1)在稳定安全剂量的前提下，可以适当加大E3型和E4型患者的每日用药剂量，或者联合其他降脂药物使用；(2)针对HDL-C为唯一异常指标的血脂异常患者，可以换用其他非他汀类降脂药；(3)TC水平高者三型均推荐使用阿托伐他汀，TG含量高者中E2、E3表型患者推荐使用阿托伐他汀，E4表型患者推荐使用瑞舒伐他汀；(4)在E2型血脂异常患者的治疗中强调对生活习惯的纠正治疗，在维持血脂水平的前提下，改善生活习惯，适当减少用药量，以减少对肝、肾、肌肉等组织器官的损害[16]；(5)E4表型个体，其LDL-C治疗后均值既无法达到2016年血脂异常防治指南中针对动脉硬化性心血管疾病(ASCVD)一级预防的理想LDL-C值(2.60 mmol/L)，也无法达到对危者调脂治疗设定的目标值(2.60 mmol/L)，血脂变化率也低于目标变化量30%[17]。因此建议临床上对E4表型且具有危险因素(高血压，糖尿病、吸烟或BMI≥28 kg/m2等)的个体进行关注，对这部分患者建议加大药物剂量。

4 结 论

本研究证实了中国人群中他汀类药物可改善ApoE表型E2、E3、E4型患者的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，其降脂疗效逐渐降低，即改善程度有E2>E3>E4。此外还发现，阿托伐他汀与瑞舒伐他汀的降脂疗效与ApoE基因分型无明显关系，吸烟饮酒影响他汀类药物降脂疗效，并显著见于E2型血脂异常患者。