肝纤维化指标与miRNA-200b、TAP联合检测与原发性肝癌预后的相关性研究

李章勇，夏 川，李刚勇，颜 彦，林应标△

(湖南省郴州市第一人民医院，1.检验医学中心；2.肝病科，湖南郴州 423000)

原发性肝癌是目前我国最为常见的一种恶性肿瘤，具有较高的致死率，全球范围内发病率均较高[1]。且原发性肝癌患者在发病早期缺乏典型的临床症状，往往确诊时已进入中晚期，临床治疗难度较大，预后多不良[2]。因此，对于原发性肝癌患者及早确诊、及早治疗在改善患者预后、提高生存率方面具有重要意义。MiR-200家族作为miRNA的重要组成部分之一，在多种肿瘤组织中均有异常表达，尤其是miR-200家族是抑制肿瘤转移的关键步骤，在肿瘤转移过程中发挥重要作用[3-4]。miR-200b为miR-200家族的重要成员，亦参与肿瘤细胞浸润、转移等多种生物学行为[5]。最近发现，正常细胞恶变时，细胞膜表面的聚糖结构发生变化，最常见的是N-链聚糖分支的增加，产生多种异常糖链糖蛋白即肿瘤异常蛋白(TAP)，可释放到体液中。当肿瘤细胞产生的TAP量达到一定程度时，即可以在末梢血液中检出[6]。亦有研究认为肝脏纤维化病情进展，最终可导致原发性肝癌。在此背景下，本研究旨在探讨miRNA-200b、TAP蛋白表达水平与肝纤维化指标联合检测在原发性肝癌疾病诊断中的意义，为临床做好原发性肝癌早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年2月至2018年1月在本院接受治疗的73例原发性肝癌患者病例资料作为研究对象，其中有男58例，女15例，年龄23～79岁，平均(57.11±8.32)岁。根据预后情况将患者分为预后良好组和预后不良组，以随访2年内复发或死亡为预后不良组，随访期间未发生病情恶化为预后良好组。结果预后良好患者45例，其中男37例，女8例，年龄23～76岁，平均(58.06±7.41)岁。预后不良患者38例，男31例，女7例，年龄24～79岁，平均(57.34±6.27)岁。两组患者性别比例、年龄等基础资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究方案经医院伦理委员会批准，入组患者及家属均对本研究方案之前同意并签署知情同意书。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)根据中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌诊断标准[7]；(2)样本采集前未经过放疗、化疗或介入治疗等措施。排除标准：(1)伴有自身免疫性疾病的患者；(2)伴有其他系统恶性肿瘤者。

1.3观察指标及方法

1.3.1标本采集 入组研究者均使用真空采血管采集空腹静脉血4 mL，室温自然凝集30 min，室温，4 000 r/min离心15 min，离心半径16 cm，移取上层血清，-20 ℃保存备用。

1.3.2miRNA-200b mRNA检测 术中采集肝组织标本，放入液氮中冷冻，之后转存于-80 ℃冰箱保存。取肝癌及癌旁组织标本，研磨，采用TRIzol试剂盒提取组织中总RNA。所有操作严格按照说明书进行，并对获得的总RNA进行检测，取A260/A280>1.8的标本完成后续实验。经反转录后得到cDNA，之后采用RT-qPCR测定肝癌组织中miRNA-200b mRNA的表达水平。

1.3.3TAP的检测 取各组研究对象指端末梢血，推制成厚薄均匀的血片3张，自然干燥。将TAP检测试剂充分摇匀，用滴管垂直滴加在血片上，每张3滴；等血片上凝聚助剂自然干燥形成圆形“斑点”，将标本置于TAP集成阅片仪下，寻找特异形态的凝聚物。TAP正常/无明显凝聚物：面积0～121 μm2；TAP异常/凝聚物较小：面积121～225 μm2；TAP异常/凝聚物较大：面积≥225 μm2。试剂和仪器均购自浙江瑞生医疗科技有限公司。

1.3.4肝脏纤维化指标 测定仪器为新产业MAGLUMIN 2000全自动化学发光仪,试剂盒由深圳市新产业生物医学工程有限公司提供,检测入组研究人群血清透明质酸(HA)，Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层粘连蛋白(LN)水平。

1.4统计学处理 采用EXCEL软件进行原始数据的录入和预处理，采用SPSS 22.2软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，采用Spearman相关性分析肝纤维化指标及血清TAP，癌组织miRNA-200b与预后的相关性，预后良好赋值为1，预后不良赋值为0，并采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平与肝纤维化指标联合检测在原发性肝癌预后的评估价值，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组患者血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA比较 预后不良组患者肝组织miRNA-200b mRNA表达量均低于预后良好组，预后良好组患者血清TAP显著高于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者血清TAP、癌组织miRNA-200b水平比较

2.2两组患者肝脏纤维指标比较 观察组患者血清 PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平及肝纤维化指标与预后的相关性分析 如表3所示，血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平对原发性肝癌诊断的临界值分别为0.58和94.02 μm2(r=-0.213、0.715，P<0.05)。肝纤维化指标PCⅢ、Ⅳ-C、LN和HA对原发性肝癌诊断的临界值分别为102.3 μg/L、98.1 μg/L、122.4 μg/L和106.5 μg/L(r=-0.512、-0.608、-0.743、-0.673，P<0.05)。

表2 两组患者肝脏纤维指标比较

2.4血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平与肝纤维化指标联合检测在原发性肝癌预后的ROC曲线分析 血清血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平与肝纤维化指标联合检测评估原发性肝癌预后的灵敏度、准确度和特异度分别为0.985、0.972和0.832。见表3、图1。

表3 血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平与

图1 血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达

3 讨 论

近年来，有研究表明肿瘤的生物学行为受到肿瘤自身及肿瘤微环境的影响，对其演变和转归均会产生重要影响[8-10]。趋化因子能够将机体免疫细胞募集至肿瘤病灶处，分泌多种细胞因子，影响肿瘤的生长及附近血管的生成[11]。有大量报道表明，TAP与多种肿瘤的发生、侵袭转移密切相关，且能够对肿瘤患者的预后进行评估[12-15]。

本研究结果表明，预后不良组患者血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平高于对照组。相关研究表明miRNA-200b mRNA高表达者中位生存期长于低表达者，表明miRNA-200b mRNA高表达可提高患者生存率，延长生存期，与杨西胜等[16]报道基本一致。推测 miRNA-200b mRNA在肝癌发生中可能发挥抑癌基因作用，高表达miRNA-200b mRNA可能通过下调E-cadherin 或直接抑制EMT而减少肿瘤细胞迁移、侵袭的发生。

TAP是肿瘤细胞在新陈代谢过程中排放的糖蛋白和钙-组蛋白复合物的总称，TAP的出现间接表示细胞癌变的数量和程度。当TAP达到一定程度后，这类物质向血液排放，并较多地存在于外周血液。TAP在肝脏肿瘤具有较高表达，阳性率为70%～95%[17]。将其作为肝癌血清学检测的指标，对发现癌前病变有较高的灵敏度和特异度。

正常肝脏细胞外基质的主要成分有蛋白多糖、LN和胶原。HA，一种蛋白多糖，在肝组织发生纤维化时，其在血清中的含量会明显升高，同时分布于内皮细胞的HA受体会相应降低，其降解途径受到抑制，因此在肝脏发生纤维化时，血清HA水平发生较大波动，是目前能够反映肝脏纤维化较为敏感的生化指标之一[18]。慢性肝炎患者的血清PCⅢ持续升高提示病情向肝硬化发生了进一步的进展，而其血清含量的降低则预示了病情有所缓解。此外，LN及Ⅳ-C也是反映肝纤维化的重要指标。随着肝炎患者病情进展，逐渐演变成肝硬化乃至肝癌，肝纤维化指标均会发生相应的变化，因此肝纤维化指标是反映机体肝脏健康状况的重要指标。本研究结果表明，预后不良组患者血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于预后良好组，说明肝癌患者的预后与肝纤维指标存在较好的相关性。

根据ROC曲线分析结果，结果表明血清血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平与肝纤维化指标联合检测对原发性肝癌疾病预后评估的灵敏度、准确度和特异度分别为0.985、0.972和0.832。说明血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平联合肝纤维化指标能够对原发性肝癌进行有效诊断，其原因是血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平作为在肝癌发生过程中即会明显变化的指标，用其预测肝脏疾病预后具有一定的临床意义，而肝纤维化是肝脏病变逐渐进展接近肝癌的一个病理期，因此两种指标联合能够兼顾特异度和准确性。

4 结 论

血清TAP、癌组织miRNA-200b mRNA表达水平与肝纤维化指标联合检测可用于对原发性肝癌的预后进行评估诊断，其灵敏度、特异度及准确度均较高，具有较好的临床应用前景。