不同修饰磁纳米颗粒提取DNA对HRM基因分型能力的影响探讨

张 敏，张俊平，杨美娟，李凌霄，郜莉娜，沈明辉，尤崇革△

(1.兰州大学第二医院检验医学中心，甘肃兰州 730030；2.中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃兰州 730030)

高分辨熔解曲线(HRM)作为一种新兴的分子诊断技术，其不受突变位点和突变类型的限制，特异度和灵敏度高，操作简便，目前已被广泛地用于生物学及医学各个领域研究[1-5]。由于HRM检测的高灵敏性，其对核酸质量的要求也相对较高。磁固相萃取技术(MSPE)由于其快速、高效以及易于自动化的特点引起了越来越多的关注[6-10]。在MSPE中，避免了产生可能导致核酸降解的离心步骤，减少物理或化学因素对核酸的损害，同时，作为固相吸附剂的磁性颗粒(MNP)可以通过施加外部磁场而被很容易地除去[11-12]。为此，本研究制备并建立了3种基于磁珠的核酸提取方法，分别以3种突变位点及突变类型(rs12641369G>A、rs3114018C>A、rs2302515C>G)为例，探讨其对PCR-HRM检测的影响，并评价检验性能。

1 材料与方法

1.1标本来源 40例全血标本来自兰州大学第二医院体检中心健康人群，平行采用天根公司的全血基因组DNA试剂盒、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4提取300 μL全血。

1.2主要试剂与仪器 六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、无水乙酸钠(NaAc)、乙二醇、聚乙二醇10000、聚乙二醇6000和无水氯化钠(天津大茂化学试剂厂)，正硅酸乙酯、壳聚糖(天津科密欧化学试剂公司)，缓冲液CL(北京天根公司)，洗脱液(日本富士公司)，Taq DNA 聚合酶和SYTO13染料(美国Life Technologies公司)，dNTP(美国Invitrogen公司)，Rotor-Gene Q PCR仪(德国QIAGEN公司)，Nano-drop 2000超微量分光光度计(美国Thermal Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1磁珠制备 首先采用水热法制备了羧基改性磁性Fe3O4纳米粒子。FeCl3·6H2O(1.35 g)溶于乙二醇(40 mL)，借助于超声波处理形成澄清溶液；再将NaAc(3.6 g)和聚乙二醇10000(1.0 g)加入到溶液中，剧烈搅拌混合物直至获得均匀的深黄色溶液；将该溶液放入聚四氟乙烯高压反应器中，在200 ℃条件下加热48 h；产物用乙醇和水洗涤数次，并在60 ℃的氮气条件下干燥10 h备用，最后得到Fe3O4磁性纳米粒子。取250 mg Fe3O4颗粒加入30 mL乙醇超声30 min；向烧杯中加入30 mL乙醇、60 mL乙醇胺及5.28 g超纯水，并搅拌均匀；将上述液体与Fe3O4颗粒溶液混匀后放入三口烧瓶，边搅拌边滴加2 mL正硅酸乙酯(500 r/min)，再将转速调至800 r/min，机械搅拌6 h，最后洗涤干燥，得到SiO2@Fe3O4。1 g Fe3O4颗粒加入一定量超纯水超声1 h，再加入100 mL 1%壳聚糖溶液(1%醋酸溶液稀释)机械搅拌24 h，取150 mg上述颗粒加入4 mL 2.5%戊二醛溶液(0.2 mol/L磷酸盐溶液配制)，200 r/min机械搅拌5 h，洗涤干燥得到CTA@ Fe3O4。

1.3.2核酸提取 柱提法核酸提取按照天根公司试剂说明书步骤进行。向300 μL EDTA-K2抗凝血液中加入300 μL无菌去离子水以破坏红细胞膜，混合数次后，将混合液以12 000 r/min离心3 min，弃去上清液；在剩余的沉淀中加入缓冲液CL(300 μL)，混合数次；将混合物以12 000 r/min离心1 min，弃去上清液；制备150 mL蛋白酶K-缓冲液FG混合液(1∶100)并加入到沉淀中，倒转几次，直至沉淀物完全溶解；将离心管放入65 ℃金属浴中温浴10 min；向上述裂解液中加入300 μL结合溶液(20%PEG，4 mol/L氯化钠，pH=2.0)，随后加入40 ng SiO2@Fe3O4/CTA2@Fe3O4/Fe3O4；室温下静置10 min；在磁力分离架上分离结合物，弃去上清液。结合物用70%乙醇溶液洗涤2次并在室温下干燥。加入50 μL洗脱液并在室温下温育10 min。最后磁分离，将洗脱液转移至新管。

1.3.3DNA质量评价 DNA提取产物中取1 μL用超微量蛋白核酸检测仪测定浓度、A260及A280，计算得率(浓度×洗脱液体积)和纯度(A260/A280)。

1.3.4引物设计与合成 使用NCBI数据库在线软件Primer-BLAST设计引物，并使用在线工具UNAfold和uMelt进行引物验证，引物由南京金思特(GenScript)科技有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 3个SNP位点的引物信息表

1.3.5PCR-HRM基因分型 反应体系10 μL，包括1 μL DNA 样本，10×PCR Buffer 1 μL，0.08 μL Taq DNA 聚合酶(浓度5 U/μL)，10 mmol /L dNTP 0.2 μL，20 μmol/L引物各0.25 μL，10×SYTO 13染料0.5 μL，50 mmol/L的MgCl20.05 μL，最后加water-DEPC至10 μL。rs12641369和rs3114018反应条件为预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共15个循环；变性95 ℃ 10 s，退火56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共25个循环。rs2302515反应条件为预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共40个循环。随后进行HRM分析，条件为95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲线温度区间为75～85 ℃，分辨率为每梯度0.2 ℃，通过熔解曲线峰型的改变进行基因分型。

1.3.6检验性能的评价 为评价灵敏度与特异度，特定义杂合和纯合突变基因型为阳性，野生基因型为阴性。灵敏度为真阳性占真阳性与假阴性之和的百分比，特异度为真阴性占假阳性与真阴性之和的百分比。重复性采用批内10次重复评价，再现性采用批间重复10次。

2 结 果

2.1DNA提取质量比较 如表2所示，统计学分析显示以离心柱法为对照，SiO2@ Fe3O4法得率与离心柱法相当，且差异无统计学意义(P>0.05)，CTA@Fe3O4法及Fe3O4法核酸提取得率均较离心柱法低，且差异有统计学意义(P<0.01)；5种方法提取核酸的纯度(A260/A280≈1.80)之间差异无统计学意义(P>0.05)。PDA@Fe3O4法和SiO2@ Fe3O4法均具有良好的核酸提取质量。

注：从左到右依次为离心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的标准化熔解曲线图(上)和求导熔解曲线图(下)；最右侧为rs12641369的测序验证图

图15种核酸提取方法rs12641369的批量PCR-HRM熔解曲线图

2.2灵敏度和特异度 在40例样本中rs12641369、rs3114018和rs2302515有2例标本由于熔解峰飘移，不能直接基因分型，其余均可直接分型(如图1～3)。这2例样本后经与已知纯合型样本混熔和重新检测后均能明确分型：所有样本检测结果与Sanger测序结果一致，4种核酸提取结合HRM方法在本次研究中灵敏度和特异度达到100%。

表2 4种核酸提取方法核酸质量的比较

注：-表示无数据

注：从左到右依次为离心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的标准化熔解曲线图(上)和求导熔解曲线图(下)；最右侧为rs3114018的测序验证图

图25种核酸提取方法rs3114018的批量PCR-HRM熔解曲线图

注：从左到右依次为离心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的标准化熔解曲线图(上)和求导熔解曲线图(下)；最右侧为rs2302515的测序验证图

图35种核酸提取方法rs2302515的批量PCR-HRM熔解曲线图

2.3重复性和再现性 在重复性实验中，离心柱法、SiO2@Fe3O4法、CTA@Fe3O4法及Fe3O4法在rs12641369位点基因型GG对应熔解曲线的Tm的CV分别为0.6%、0.6%、0.8%和1.2%；t检验发现野生型和纯合型Tm值差异均具有统计学意义(P<0.05)。在rs3114018位点基因型CC的TmCV分别为0.4%、0.8%、0.5%和1.3%；t检验发现野生型和纯合型Tm值差异均具有统计学意义(P<0.05)；在rs2302515位点基因型CC的TmCV分别为0.7%、0.8%、0.5%和1.5%；t检验发现野生型和纯合型Tm值差异均无统计学意义(P>0.05)。由于rs2302515C>G的纯合型与野生型Tm值极为接近，本研究通过车轮式混溶的方法区分了所有样本的基因型。再现性实验也显示，所有核酸提取方法及SNP位点对应的熔解曲线Tm值的CV均在0.4%～1.5%，尽管批间的熔解曲线有轻微的波动，但不影响基因正确分型。

3 讨 论

HRM技术和其他SNP基因分型方法(限制性片段长度多态性法、Taqman荧光探针法等)相比，不需要设计序列特异度探针，不需要PCR后处理，全程闭关操作，减少了污染的风险，同时还具有检测高效快速、灵敏度高、操作简单、检测费用低廉等优点[13]。但影响HRM检测结果准确性的因素很多[14]，除PCR本身反应体系外，往往忽视标本核酸模板提取对结果的影响，且较少系统评价其对检验性能的影响。目前，仅有少量文献报道运用磁性纳米颗粒提取基因组DNA，同时，市面上所销售的磁珠法核酸分离试剂盒，大多数为国外产品，价格昂贵，很难得到广泛应用[15]。本研究对3种自建的基于磁珠法的PCR-HRM检测系统进行了方法学的性能评价，结果显示，与测序法比较，该方法的对3个位点(rs12641369G>A、rs3114018C>A、rs2302515C>G)分型的灵敏度和特异度均达到100%。2例样本在检测时存在扩增曲线异常偏离群体，原因可能与模板操作失误或模板质量有关。重复性与再现性结果表明离心柱法与磁珠法结合PCR-HRM进行基因分型均具有较好的批内精密度，特别是G>A及C>A突变类型能够通过熔解曲线峰型清楚地区分野生型与纯合突变型。尽管不同修饰的磁珠提取效果各有差异，但HRM技术对检测模板质量的轻微波动可以耐受，在检测过程中仍可保证检测结果的准确性及稳定性。

4 结 论

本研究制备的3种磁性纳米颗粒(SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4、Fe3O4)均可用于核酸提取及PCR-HRM检测，但在提取核酸得率及检验性能方面，SiO2@Fe3O4更佳；磁珠提取结合PCR-HRM方法的建立有效缩短了实验时间，提高了实验效率，节省了工作成本，为后续的分子生物学研究提供了理论依据。另外，本研究所制备的磁珠有望实现自动化核酸提取，从而降低手工操作带来的污染及误差。