骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

周珂，辛智倩，刘佩娟，马翠，师长宏，王华，张海*

(1. 空军军医大学实验动物中心，西安 710032； 2. 安徽医科大学药学院，合肥 230032)

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)属于转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族，是一类多功能生长因子。到目前为止，已发现超过20种BMP相关蛋白，并根据其氨基酸序列及功能将其分为四种亚家族。其中，BMP9和BMP10组成一种亚家族，在胚胎干细胞分化、成骨形成、血管生成、糖脂代谢等方面中起到重要作用[1]。BMP9作为成骨作用最强的BMPs家族成员也受到越来越多的关注。

BMP9又称为生长分化因子2(growth and differentiation factor 2, GDF2)，主要由肝细胞产生，且有研究发现其mRNA在中枢神经系统和骨骼肌中也有少量表达[2]。BMP9不同于其他BMPs家族成员的是其对受体的选择性以及对信号调节的敏感性，它与激活素受体样激酶1(activin receptor-like kinase 1, ALK1)有高度亲和力[3]，结合后能够激活Smad依赖性BMP信号通路，从而影响细胞生长发育等生理过程[4]。近年来，大量文献报道BMP9参与多种生物学进程，当BMP9信号失调时，能够诱发多种疾病，如肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症，肝疾病等[5-7]。研究发现，在肝纤维化疾病进程中，肌成纤维细胞的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白合成增多是纤维化形成的一个重要机制，BMP9能够通过与ALK1或ALK1与ALK5复合体结合，使Smad1/5/8磷酸化，同时激活其他肝纤维化相关受体，上调ECM蛋白的表达，因此其具有促纤维化的功能[8]。但其具体发病机制尚不明确，针对这些疾病的相应治疗也不完善。

随着CRISPR/Cas9技术的日益成熟，用于各种疾病研究的动物模型也逐渐增多。通过构建基因敲除动物模型，能够快速了解目的基因对疾病进程的作用，帮助研究者明确其作用机制，以此找到有效方法来预防和治疗疾病。为进一步研究BMP9对肝纤维化的影响，本研究以CRISPR/Cas9技术为基础，构建BMP9基因敲除小鼠。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6周龄SPF级C57BL/6小鼠，体重20～22 g，由空军军医大学实验动物中心提供【SCXK(陕)2014-002】，6～8周龄ICR母鼠购于北京维通利华公司【SCXK(京)2012-0001】，均饲养于屏障设施【SYXK(陕)2014-001】中。

1.1.2 试剂与仪器

sgRNA体外转录试剂盒及纯化试剂盒购自Ambion公司。Cas9 mRNA购自南通百奥迈科公司。DNTPs和Taq酶购自Takara公司。BMP9抗体购自Proteintech公司。pX330质粒由北京艾德摩公司提供。PCR产物纯化试剂盒购自天根生物公司。小鼠基因组DNA提取试剂盒由福际生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA重组质粒的构建

根据Genbank报道的Bmp9基因序列，确定Bmp9基因敲除的靶位点。应用http://crispr.mit.edu 网站分析并设计20 bp的sgRNA序列，再根据选择的sgRNA序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。将Oligos退火后以T4连接酶连接到带有T7启动子的pX330质粒载体上，构建含有sgRNA的重组质粒。

1.2.2 体外转录

上述质粒和pX330为模板，通过PCR反应扩增sgRNA序列，PCR产物纯化后进行体外转录。转录按文献报道进行[9]，转录产物纯化后于-80℃保存备用。

1.2.3 显微注射及胚胎移植

6周龄C57BL/6雌性小鼠超数排卵后与雄鼠合笼，挑选见栓雌鼠，剖开腹腔，在输卵管壶腹部收集受精卵细胞。将转录好sgRNA和Cas9以2∶1混合，运用Eppendorf NK2 显微注射仪将混合物直接注射入受精卵细胞中，于5% CO2、37℃培养箱中培养24 h，挑选成活受精卵细胞移植入假孕ICR母鼠输卵管中。

1.2.4 基因型鉴定和纯合子的筛选

待首建鼠发育至1周时，剪取鼠尾，加入裂解液后，通过试剂盒提取基因组DNA，以此作为PCR模板，进行基因突变鉴定。将突变的首建鼠与野生型C57BL/6交配，得F1代杂合子，F1代互交即可筛选出F2代纯合子。

1.2.5 BMP9在肝组织中的表达

(1)Western Blot

处死小鼠后取肝组织，加入RIPA裂解液后匀浆，提取总蛋白。蛋白定量后，加入RIPA裂解液和5×上样缓冲液配成样品，90℃水浴10 min使蛋白变性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜至PVDF膜上，封闭2 h，一抗为BMP9抗体，稀释比例为1∶500，4℃过夜孵育，二抗为山羊抗兔工作液，稀释比例1∶4000，室温孵育2 h，ECL发光，成像分析。

(2)qPCR

处死小鼠后取肝组织，加入TRIzol匀浆裂解，提取组织RNA，反转录为cDNA后，通过BMP9特异性引物进行qPCR检测。扩增反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 个循环。数据分析采用 2-△△CT值计算目的基因相对表达量，其中各组织中Bmp9表达量以心脏为对照，敲除小鼠体内Bmp9表达量以野生型小鼠为对照。

(3)免疫组化

处死小鼠后取肝组织，使用4%多聚甲醛固定，24 h后石蜡包埋，切片。通过免疫组化检测BMP9表达。一抗为BMP9抗体，1∶200的比例稀释；二抗为山羊抗兔工作液。

2 结果

2.1 构建质粒及体外转录

参照Genbank报道的Bmp9序列，利用http://crispr.mit.edu网站设计针对Bmp9基因第1外显子的一段sgRNA序列，Bmp9-上游引物：5’-CACCgtgtacaagtcgatcatgtac-3’；Bmp9-下游引物：5’-AAACgtacatgatcgacttgtacac-3’。sgRNA序列两端引入Bbs I酶切位点后交由公司合成两端互补序列。合成的sgRNA退火后克隆入pX330质粒。以此为模板，通过PCR大量扩增sgRNA，纯化后的sgRNA，在T7启动子的介导下进行体外转录，转录产物经过琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，得到大小约为112 bp的PCR产物(见图1)。通过紫外分光光度计检测，得出OD260/230=2.3，OD260/280=1.9。

2.2 基因型鉴定

Cas9和sgRNA转录产物显微注射入供体受精卵细胞后，将其移植到假孕受体母鼠体内，分娩得到F0代小鼠。F0代动物经过提取鼠尾DNA测序后，结果显示存在两种基因型的突变小鼠，一种为13 bp缺失并伴有1 bp插入突变(见图2A)，另一种为5 bp缺失突变(见图2B)。F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代杂合子，杂合子再经过互交筛选得到F2代纯合子。

图1 sgRNA转录产物Figure 1 Transcription products of sgRNA

图2 Bmp9基因敲除小鼠的基因型Figure 2 Genotype of the Bmp9 knockout mice

2.3 BMP9在敲除小鼠肝组织中的表达

2.3.1 BMP9 mRNA和蛋白在敲除小鼠中的表达

为了准确研究BMP9功能，我们首先检测野生型小鼠心脏、肝、脾、肺、肾等主要脏器中BMP9 mRNA的表达水平。结果发现BMP9主要在小鼠肝脏表达，其他脏器表达很低或不表达(图3)，这与文献报道一致[2]。因此在敲除小鼠表型鉴定中，我们只提取敲除小鼠肝脏的mRNA和蛋白进行分析，以BMP9特异性引物(上游引物序列为5’-CCACCCCAGTACATGATCGAC-3’；下游引物序列为5’-GGATGTGCTTCTGAAAGGGGA-3’。)通过qPCR检测后发现小鼠肝脏中mRNA几乎不表达，Western blot也证明BMP9蛋白表达水平很低(图4、5)。这些结果表明BMP9已成功敲除。

图3 qPCR检测BMP9在野生型小鼠各脏器中的表达Figure 3 Expression of BMP9 in different organs of wide-type mice detected by qPCR

图4 qPCR检测BMP9在肝组织中的表达Figure 4 Expression of BMP9 in the liver detected by qPCR

图5 Western blot检测BMP9在肝中的表达Figure 5 Expression of BMP9 in the liver detected by Western blot

2.3.2 免疫组化

取F2代小鼠肝组织，在 4%多聚甲醛中固定，24 h后石蜡包埋，切片，进行免疫组化。结果显示(见图6)与野生型C57BL/6相比，BMP9在基因敲除小鼠肝组织中的表达量显著下降。

图6 免疫组化检测BMP9在肝中的表达(×40)Figure 6 Expression of BMP9 in the liver detected by immunohistochemistry(×40)

3 讨论

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统是一种原核生物的免疫系统，CRISPR被称为“规律间隔成簇短回文重复序列”，是在一些细菌基因组内存在的一系列成簇排列的DNA序列，这些重复序列和很多能够侵入细菌的噬菌体的DNA序列相同。研究者发现，噬菌体病毒或外源质粒入侵细菌时，CRISPR/Cas系统能够识别这些外源DNA，这些序列在被转录成为RNA后，能够和细菌产生的CRISPR关联蛋白形成复合体，对Cas9蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA(gRNA)。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas9蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。以此为基础衍生的CRISPR/Cas9基因编辑系统在基因治疗、动物模型等领域显现出良好的应用前景，与传统基因打靶技术相比，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、效率高等优点，目前应用CRISPR/Cas9技术可实现基因敲除、基因敲入等，是构建基因修饰动物的重要工具。本研究我们针对Bmp9外显子设计20 bp的sgRNA序列，体外转录后可介导Cas9在靶向区域定向切割，引起Bmp9基因读码框位移，从而导致BMP9蛋白表达水平改变，证明CRISPR/Cas9基因编辑是构建基因敲除动物良好工具。

根据文献报道，BMP9可以与ALK1、BMPRⅡ、内皮素等结合，抑制内皮细胞，激活BMP相关信号通路，从而参与多种生理活动[10]。BMP9早期的研究主要集中在血管生成领域，如肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症。随着对BMP9了解的深入，研究者发现其在肿瘤、肝、神经系统等方面都有着一定的影响，Maegdefrau等[11]通过RT-PCR 检测发现BMP9在肝细胞性肝癌Hep3B和PLC/PRF/5细胞中高表达，Herrera 等[12]发现BMP9可以促进肝癌细胞增殖，激活Smad1/5/8磷酸化。这提示我们Bmp9基因敲除后，可能会改善肝疾病进程，因此通过敲除Bmp9基因构建肝疾病模型，能够为后续研究提供良好的研究条件。