应用基因芯片技术研究硫酸氨基葡萄糖对骨性关节炎相关炎性基因表达谱的影响

桑 平,李高峰,李雪鹏,张季铠

(吉林省人民医院 骨科,吉林 长春130021)

关节骨性关节炎是最常见的骨骼肌肉疾病，是一种危害成人健康的慢性渐进性疾病，是与年龄相关的、关节软骨细胞合成与分解代谢失衡造成的骨关节疾病[1]。其病理特点是关节软骨的破坏，细胞外基质的减少，软骨下骨的改变及关节的炎症改变。关节的炎症影响和参与已被广泛认可，这种自身炎症反应引起分解代谢旺盛及软骨细胞凋亡，最终引起关节软骨的降解，引起一系列的临床症状，其中前列腺素E2在骨关节炎的发病中具有重要作用[2]，参与前列腺素E2的三种酶分别为：磷脂酶A2、胶原酶及前列腺素合酶，虽然病因已经明确，但是仍没有有效率的预防和治疗手段[3,4]。基因芯片技术作为高通量、高敏感基因组学的研究技术，目前已被广泛应用于临床医学研究领域，它通过成千上万个探针点结构，摄取细胞或组织标本的mRNA表达水平，然后通过对不同生理病理条件下提取的mRNA的表达进行平行比较，可在更深层次上认识器官的病理或生理现象。Affymetrix的体系及系统是国际上应用最多和技术成熟的平台，它提出了基因标准化的概念，实现了数据的共享性、客观性和可比性[5]。基因芯片技术对于软骨代谢失衡的分子机制的进一步明确，将能使关节骨性关节炎的预防及治疗得到改善。致病的相关的基因其中大量基因为细胞因子所介导或者炎性介质基因，基因芯片技术为该病的分子遗传学研究提供了新的思路[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

标本来源及分组：收集9例关节软骨组织样本，其中正常膝关节软骨样本3例来自我院创伤骨科因暴力碾挫伤而行截肢手术的患者股骨髁软骨组织，6例来源于髋关节骨性关节炎关节置换手术患者软骨样本,患者均参照ACR髋关节骨性关节炎诊断标准选择，患者平均年龄为54岁。

1.2 方法

将采集的软骨细胞进行体外培养、刺激及鉴定，-75℃冰箱冻存。然后行基因表达谱芯片检测程序，首先Trizol法行总RNA提取、质量检测及纯化，体外转录(IVT)cRNA合成及随机引物反转录，样品标记和杂交Realtime-PCR反应及ELISA检测，流程结束后，离心并将芯片洗涤和准备扫描。

1.3 数据分析及统计学方法

采用Affymetrix Gene Human Genome U133 Plus 2.0 Array软件及Affymetrix miRNA v2.0芯片技术联合应用进行RMA分析，对炎症状态下损伤细胞和正常软骨细胞的组基因及miRNA表达谱进行构建并进行信息学分析，包括背景校正，将探针信号过滤整合为probeset信号等，取得分析报告数据。使用信号比值方法进行Ratiocompare比较分析，计算两组间基因谱表达差异的显著性水平(P值)和误判率,从而得到差异基因，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外软骨细胞培养及总RNA质检结果

体外分离培养活跃的软骨细胞(图1)，所有正常对照组、炎性对照组、药物干预组的软骨细胞经裂解后行RNA质检。使用SMA3000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳质检实验，检测RNA的浓度、纯度及完整性，质控证实已经提取到高纯度的总RNA。

图1 正常状态下活跃的软骨细胞

2.2 炎症介质白细胞介素18刺激可引起软骨细胞炎症合成通路的基因表达谱异常表达

白细胞介素包括促炎性和抑制炎性的白细胞介素，其中促进炎症白细胞介素18在骨性关节炎病理生理过程中是关键因素，为了验证白细胞介素18对关节软骨细胞炎症合成通路基因表达谱的影响，我们分别将培养板设为正常对照组、炎性对照组(白细胞介素18刺激组)并对之行芯片检测。炎性对照组与正常对照组相比，基因表达及细胞信号合成通路存在明显表达异常(图2)。其中与前列腺素E2及磷脂酶A2、胶原酶代谢有关的基因为：ACAN、COL2A1、PTGES、PTGS2、IL1a、IL6、IL17等基因均上调； MMP、MEZ及IFN等基质降解酶类基因上调。本组实验表明白细胞介素18能够增加前列腺素E2信号合成通路关键酶基因表达，同时激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路，有效的促进炎症的发生及软骨组织的降解。

2.3 硫酸氨基葡萄糖对骨性关节炎关节软骨细胞反应通路基因表达谱的影响

图2 表达上调的基因，横轴为炎性对照组/正常对照组基因表达的比值

为了验证硫酸氨基葡萄糖对骨性关节炎关节软骨细胞炎症合成通路基因表达谱的影响，我们将培养板分别设为炎性对照组(白细胞介素18刺激组)、药物干预组(硫酸氨基葡萄糖+白细胞介素18)，分别提取软骨细胞进行基因芯片检测。与炎性对照组相比，药物干预组基因表达及细胞信号合成通路存在明显表达异常。其中ACAN、COL2A1、PTGES、PTGS2、IL1a、IL6、IL17等与前列腺素E2、磷脂酶A2及胶原酶炎症有关的基因基因下调；IL4、 IL10、 IL24、PTGS1抑制炎性基因上调；CXCL13、TNFRSF9、TNFSF10、VEGFA等诱导软骨细胞凋亡相关的基因下调；抑制凋亡基因ADATm-4、BCL2、FGF18、TRAF1等基因上调。本实验证明硫酸氨基葡萄糖能够抑制骨关节炎关节软骨细胞前列腺素E2合成通路关键酶胶原酶和磷脂酶A2基因的表达，减少前列腺素E2生成，同时抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路，从而控制炎症的发生及软骨细胞的降解。

3 讨论

骨性关节炎是一种逐渐丧失关节功能和肢体活动能力从而降低生活质量的退行性疾病，其发生、发展是一个多阶段过程，其病理特点是关节软骨的破坏，细胞外基质的减少，软骨下骨的退变及关节的炎症改变。但是还没有有效的预防及治疗手段，许多易感因素会造成膝关节骨性关节炎的发生及进展，它是一个与年龄相关的、软骨基质降解与修复失衡而产生的疾病[7]，并由炎症及应压力加速病变的发展[8]，关节的炎症影响和参与已被广泛认可，这种自身炎症反应引起分解代谢旺盛及软骨细胞凋亡，最终引起关节软骨的降解，引起一系列的临床症状，前列腺素E2是巨噬细胞产生的一种脂肪酸代谢产物，在骨关节炎的发病中具有重要作用[9]，参与前列腺素E2生成的主要二种酶分别为：磷脂酶A2及胶原酶。关节炎症状态下，白细胞介素18能够增加前列腺素E2信号合成通路关键酶基因表达，同时激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路，有效的促进炎症的发生及软骨组织的降解。胶原酶和磷脂酶A2由各种细胞因子、介质诱导产生于炎症反应具有重要作用。使用硫酸氨基葡萄糖治疗膝关节骨性关节炎，作用机制是能够调控减轻炎性反应、减少细胞外基质降解、降低关节软骨细胞的凋亡及改善稳定软骨细胞内环境的作用。实验表明硫酸氨基葡萄糖不仅可以抑制胶原酶和磷脂酶A2的活性，同时也可以减少胶原酶和磷脂酶A2基因的表达，从而达到控制前列腺素E2炎症信号合成通路关键酶类表达的作用，有效的控制炎症的发生及关节软骨的降解。

基因芯片技术又称DNA集微芯片、DNA微阵列技术，其主要原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术，通过技术手段将DNA片段固定到介质上，随后将荧光标记样本与其杂交，从而对样本基因进行规模检验，随着DNA重组技术和分子生物学的发展，特别是在2005年人类基因组DNA全序列绘制完成，基因芯片技术已成为基因功能分析研究的最重要技术之一，诊断疾病是基因芯片最具有价值的应用，通过对炎症状态下致病基因表达谱的研究可为关节骨性关节炎的发病机制提供新的研究思路和更有效的治疗方法。基因芯片技术是以精度、准度及整体的系统的方法进行研究，宏观的研究生物基因的表达和功能。其将核苷酸分子固定于介质上，然后与基因芯片上探针列阵杂交，由于列阵中特定位置上的核苷酸序列是已知的，所以利用Affymetrix系统对芯片上每一探针位点荧光信号的强度进行检测和比较，即可对样本的信息进行定量定性分析，基因芯片技术克服了传统核苷酸杂交技术复杂性、自动化程度低及检测分子数量少等缺点，可以将克隆到的大规模基因特异性探针或DNA片段固定在一块芯片上，制成表达谱芯片，对基因表达个体特异性、组织特异性及病变特异性进行科学的比较分析，通过研究基因正常表达与异常扩增、基因与基因之间相互协同作用关系、不同的生理病理状态下筛选出在疾病各个环节及阶段起关键性调控作用的基因，进而将这些关键基因与疾病联系起来，对疾病发病机制提供新的研究思路和更有效的治疗方法。基因芯片技术具有高灵敏度、高通量、高速度、高研究效率、高集成等优越性，可以对疾病多因素、基因多样性进行全面、综合、系统的分析，因此未来基因芯片技术在骨科疾病的基础和临床研究领域必将得到更广泛的应用。