香芹酚处理对枸杞鲜果采后黑霉病的控制

王军节,李贞彪,张怀予,王 鹏,范春霞,陈善贵,崔美丽,邓淑芳,赵鲁迺克

(1.北方民族大学植物性农产品贮藏与加工重点实验室,宁夏银川 750021;2.北方民族大学生物科学与工程学院,宁夏银川 750021;3.江西枫树食品生态科技有限公司,江西宜春 330700)

宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)果实因富含营养和活性成分而成为理想药食资源,在国内外市场享有盛誉[1-3]。目前,该果主要以干制、榨汁和酿酒等加工产品进行商业化流通,但加工过程会造成其营养和活性成分损失[4-6]。随着消费者对天然且新鲜果品的日益追求,其活性成分得以最大程度保留的鲜果市场份额将日益增大[7-8]。

枸杞浆果小而多汁,组织极易遭受真菌侵染而腐烂变质[9-10]。链格孢是引起枸杞霉变的主要病原菌[11-12],因其具有潜伏侵染和耐低温能力已成为鲜果冷链物流中主要问题[13-14]。虽然杀菌剂戴挫霉可有效控制枸杞鲜果采后病害,但存在环境污染、食品安全和抗药性等问题,因此开发新型安全控制防腐措施十分必要[15]。

植物精油是植物体内具有较强挥发性的次生代谢产物,具有明显的抑菌活性、低毒且对环境影响小,已被证明是一种具有控制采后病害潜力的安全措施[16]。这其中,香芹酚(2-甲基-5-异丙基苯酚)是一种来自牛至和百里香等植物精油,因其天然安全和良好抑菌活性，在美国和欧洲被批准为食品添加剂[17-18]。研究发现,香芹酚能控制炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、根霉(Rhizopusstolonifer)和曲霉(Aspergillusflavus)等病原引起的荔枝炭疽病[19]、桃软腐病[20]和樱桃番茄[21]腐烂等采后病害。然而,有关香芹酚对链格孢菌的直接作用以及对枸杞黑霉病抑制效果的研究鲜有报道。

本试验以链格孢菌为研究对象,通过体外分析香芹酚对其菌丝扩展、孢子萌发和超微结构的影响,并调查香芹酚对宁夏枸杞鲜果黑霉病发病率和病斑扩展抑制效果,以及分析测定处理后果实体内过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性,以期探明香芹酚控制枸杞黑霉病效果和初步机制,旨在为香芹酚控制宁夏枸杞采后黑霉病机制提供依据,也为开发枸杞采后绿色安全防腐剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁杞5号(LyciumbarbarumL.cv.Ningqi 5) 分别于2017年7月和2018年9月购于宁夏农林科学院枸杞研究所,挑选无病虫害、大小均一的鲜果;链格孢菌(Alternariaalternata) 从采后枸杞自然发生黑霉病害部位中分离而得;葡萄糖、琼脂粉等 分析纯,均购于天津市大茂化学试剂厂;香芹酚 纯度为98.0%,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物仪器股分有限公司;SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;HPS-250生化培养箱 中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司;BA210-T生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司;S-3400N扫描式电子显微镜 日本日立高新技术有限公司;UV-9000S紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;H2100R高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香芹酚处理对链格孢菌体外抑制效果测定

1.2.1.1 病原菌的分离及纯化 采集有黑霉病症状的枸杞果实,用75%乙醇进行果实表面消毒,再用无菌水冲洗后切取病健交界处的组织,在无菌条件下移至马铃薯葡萄糖(PDA)培养基上,然后置于28 ℃保温培养,待其长出分生孢子后再进行单孢子纯化,并通过回接试验确定其致病性[22]。分离纯化的病原物在马铃薯葡萄糖(PDA)培养基上保存备用。

1.2.1.2 香芹酚对链格孢菌丝生长的影响 参照Yao等[23]的方法并作改进。将浓度分别为0、0.5、1、2、4和8 μL/L的香芹酚加入已灭菌并冷却至45 ℃的PDA培养基中。再打取0.5 cm的链格孢菌菌饼接种在凝固后的培养基中心,于28 ℃避光条件培养7 d后,用十字交叉法测量菌落直径,每个处理3次重复。

1.2.1.3 香芹酚对孢子萌发的影响 参照Liu等[24]方法并修改。香芹酚分别加入含4 mL PDB培养基的试管中,使其最终浓度分别为0、1、2、4和8 μL/L,再加入400 μL 振荡均匀的浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液,于28 ℃培养。每隔4 h用显微镜观察孢子萌发情况,每次观察至少200个孢子,重复3次。

1.2.1.4 香芹酚对菌落形态及菌丝超微结构的影响 参照吴静等[25]方法并做修改。取抑制效果最佳的含药物PDA平板及对照组菌饼(3.0 mm×3.0 mm)若干,用体积分数为2% 的戊二醛在4 ℃冰箱中固定2 h后,换用0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液浸泡3次,每次间隔2 h;后固定阶段,除去菌饼中的缓冲液,加入体积分数为1%锇酸溶液将菌丝表面覆盖,浸泡2 h,固定阶段在4 ℃下进行。脱水处理阶段,用体积分数为30%、50%、70%(4 ℃条件下进行)、80%、90%(室温下进行)的系列乙醇脱水,每次10 min,再用100%乙醇脱水2次,每次15 min。75%的叔丁醇置换20 min后放置于-20 ℃冰箱中30 min。最后样品用临界点干燥器干燥。制好的扫描电镜标本在S-3400N扫描式电子显微镜下观察并在相同倍数下收集对照组和处理组的照片。

1.2.2 香芹酚处理对果实抗病性的影响

1.2.2.1 枸杞的熏蒸处理 选择大小、果色均匀一致、无伤无病、未经处理的枸杞果实,用75%乙醇擦拭果实表面消毒并晾干酒精,将80个左右的枸杞鲜果放入聚苯乙烯盒(PE)中,在盒盖子中心用透明胶带贴一张滤纸,并在盖子中心打直径为2 mm左右的小孔,按0、1、2、4和8 μL/L浓度梯度从不同盒子的小孔分别加香芹酚溶液到滤纸上,立即将小孔和盖子完全密封熏蒸处理24 h,处理结束打开盖子平衡6 h[26]。处理果实于PE保鲜盒中在(25±2) ℃、RH 85%～95%条件下贮藏待用。

1.2.2.2 香芹酚处理对枸杞果实黑霉病的控制 取在PDA培养基上培养7 d的链格孢菌,用无菌蒸馏水配制浓度为1×106个/mL孢子悬浮液[27]。用75%乙醇擦拭枸杞果实表面消毒,接种针经酒精灯火焰灭菌并晾凉,取出香芹酚熏蒸处理24 h后的枸杞果实,在每个果实赤道部位刺1 mm大小均匀的孔,并在孔内接种2 μL孢子悬浮液,晾干后果实放入PE保鲜盒中并置于(25±2) ℃、RH 85%～95%贮藏。按下式计算发病率;用游标卡尺进行十字交叉法测量病斑直径,并计算病斑面积,每个处理重复3次。

1.2.2.3 POD和PAL酶活性测定 分别取室温贮藏0、1、2、3、4、5 d各个处理果实进行酶活测定样品制备。首先将枸杞籽去除,然后将果肉组织混匀并用锡箔纸包裹,液氮速冻后在-80 ℃超低温冰箱中保存待用。每个时间点每处理用果30个,重复3次。

POD活性测定:参照Wang等[28]方法并修改。取3.0 g果肉组织,加3 mL pH7.5的50 mmol/L磷酸提取缓冲液(内含4% PVP(W/V),1 mmol/L聚乙二醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),0.01% TritonX-100(V/V)),冰浴条件下研磨成匀浆,4 ℃ 15000×g条件下离心20 min,取上清液为粗酶液。POD酶活反应体系为:2.7 mL 25 mmol/L愈创木酚、50 μL粗酶提取液和250 μL 250 mmol/L H2O2,分别加入后迅速混合,记录反应体系在波长470 nm处的吸光度,观察3 min内吸光度的变化并每隔1 min记录1次吸光度。酶活以每分钟内OD470变化为1个活力单位U,活性表示为每克鲜重果肉组织活性,即为U/g FW,每样品重复测3次。

PAL活性测定:参照Wang等[28]方法并修改。取3.0 g果肉组织,加入3 mL 0.1 mol/L的硼酸缓冲液(pH8.8,内含10% PVP(W/V),1 mmol/L EDTA 和50 mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴条件下充分研磨,然后于4 ℃ 15000×g条件下离心30 min,收集上清液并立即用于酶活性测定。PAL酶活性反应体系为:2.7 mL 7 mmol/L底物混合液(L-苯丙氨酸用硼酸缓冲液配置),20 μL粗酶液,30 ℃下反应30 min,立即加入200 μL 6 mol/L HCl终止反应。在290 nm处测定吸光度值,酶活以每分钟内OD290变化为1个活力单位U,活性表示每克鲜重果肉组织活性,即为U/g FW,每样品重复测3次。

1.3 数据统计分析

实验数据用SPSS 16.0软件进行统计处理,计算标准偏差或进行Duncan’s多重差异显著性分析,p<0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 香芹酚处理对链格孢菌的体外抑制效果

2.1.1 香芹酚对链格孢菌菌丝生长的影响 香芹酚处理对链格孢菌菌落直径扩展的影响如图1所示。由图可知,不同浓度香芹酚处理均能显著抑制菌落直径扩展,菌落直径随着香芹酚浓度增加而减小,其中0.5和1 μL/L浓度处理后菌落直径无显著差异,而8 μL/L浓度处理菌落直径为1.6 cm,仅为对照的19.19%。因此,8 μL/L对链格孢菌菌落生长抑制效果最佳。

图1 香芹酚处理对链格孢菌落直径扩展的影响

2.1.2 香芹酚对链格孢菌孢子萌发的影响 香芹酚处理对链格孢菌孢子萌发的影响如图2所示。由图可知,链格孢孢子萌发率随培养时间的延长逐渐增加,香芹酚处理后链格孢的孢子萌发率在各时间段内均显著低于对照,且浓度越大,抑制效果越明显,但低浓度香芹酚(<4 μL/L)处理链格孢的孢子萌发抑制效果不明显。而在16 h时,8 μL/L高浓度香芹酚处理组其孢子萌发率仅为38.5%,显著低于对照组的萌发率(89.9%)(p<0.05)。因此,8 μL/L对链格孢菌孢子萌发抑制效果最好。

图2 香芹酚处理对链格孢菌孢子萌发的影响

2.1.3 香芹酚对链格孢菌菌丝和孢子形态超微结构的影响 香芹酚处理对链格孢菌菌丝和孢子形态超微结构的影响如图3所示。由图可知,在500倍扫描电镜下观察发现对照组的菌丝粗细均匀,没有出现不规则分支、塌陷等现象(图3A),香芹酚处理过的链格孢菌丝量较少,表面粗糙,出现不规则分支,粗细不均匀,折叠扭曲盘绕,部分出现塌陷变形现象(图3B)。在5000倍扫描电镜下观察发现处理组的孢子数量较对照组稀疏(图3C、图3D),处理组孢子表面有白色粒状物且细胞肿胀变形(图3D)。

图3 香芹酚对链格孢菌丝和孢子形态超微结构的影响

2.2 香芹酚处理对果实抗病性的影响

2.2.1 香芹酚处理对枸杞果实黑霉病发病率和病斑面积的影响 不同浓度的香芹酚处理枸杞果实后损伤接种A.alternata,发病率和病斑面积均随着贮藏时间延长而增加(图4)。4 μL/L能显著抑制2 d后黑霉病的发病率,该浓度处理后2、3、4 d的发病率分别比同期对照低33.3%、60%和39.99%(图4A)。接种第4 d仅4 μL/L的香芹酚处理显著抑制了病斑的扩展,随着时间延长,其它浓度香芹酚处理也能显著抑制病斑面积扩展,其中以4 μL/L效果最佳(图4B)。

图4 香芹酚处理对枸杞果实损伤接种黑霉病发病率(A)和病斑面积(B)的影响

2.2.2 香芹酚处理对果实过氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性的影响 香芹酚处理对枸杞果实POD和PAL活性的影响如图5所示。枸杞果实短期贮藏期间POD活性呈先降低后略有升高趋势,各个浓度香芹酚处理均能提高短期贮藏(2～5 d)POD活性,其中4 μL/L效果最明显(图5A),该浓度香芹酚处理后果实第2、3、4、5 d的POD活性分别为同期对照的2.24、1.55、2.09和1.55倍(图5A)。PAL在短期贮藏期间呈先略有降低再略有升高趋势,4 μL/L在处理2 d后的各个阶段均显著高于对照,其中第3、4、5 d最明显,分别比同期对照高33.34%、52.04%和27.41%(图5B)。

图5 香芹酚处理对枸杞果实POD(A)和PAL(B)活性的影响

3 讨论与结论

本研究体外试验结果发现:不同浓度香芹酚对链格孢菌的体外抑制效果存在浓度依赖效应。该结果与王新伟等[29]研究香芹酚对黑曲霉、胡珊等[19]研究香芹酚等多种精油对荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、以及Pérez-Alfonso等[30]研究香芹酚对青霉(Penicilliumitalicium)作用效果基本一致。电镜观察结果表明:香芹酚对链格孢菌丝和孢子形态超微结构产生了破坏作用,由此推测香芹酚可能是通过改变菌丝体及孢子的细胞膜和细胞壁等细胞器的形态结构,造成细胞不可逆损伤,最终导致微生物死亡[31];或者是通过影响病原菌的细胞代谢从而来抑制菌丝生长和孢子萌发[32-33];此外,香芹酚是一种酚类化合物,酚可以与膜蛋白相互作用,这可能导致膜结构和功能的变形[32],而膜的变形和功能障碍可干扰真菌细胞内ATP的产生,主要抑制ATP产生的酶和底物使用[34-35],最终表现出对病原真菌很强的抑制能力。

香芹酚处理能够抑制损伤接种果实的发病率和病斑面积的扩展,并且对黑霉病控制与诱导果实POD和PAL活性相关。POD 是植物体内重要的抗氧化酶,在植物抵抗病原菌中发挥重要作用,可以通过催化H2O2和酚类物质聚合增强结构抗性[27]。PAL为苯丙烷代谢途径中的第一关键酶,参与酚类、植保素和木质素等抗菌物质的合成来提高植物的防卫反应[36-37]。因此,香芹酚处理枸杞提高了果实POD和PAL活性有利于其抵抗黑霉病。汪开拓等[38]研究表明茉莉酸甲酯(MeJA)处理可显著抑制葡萄果实在贮藏期间腐烂率和失重率的上升,同时可显著诱导植保素合成相关酶的活性来提高果实抗病性。潘磊庆等[39]研究发现丁香精油可有效抑制灰葡萄孢及匍枝根霉的生长,并诱导樱桃番茄防御性酶POD活性的升高。王双辉等[40]研究发现香芹酚浸泡处理能显著降低杨梅果实的腐烂程度,表现出良好的抑菌效果。由此可知,香芹酚不但具有对病原菌直接治愈效果,还能通过诱导抗病性起到预防目的,具有控制枸杞鲜果采后黑霉病潜力。但有关香芹酚的直接抑菌和诱导抗性的深层机理尚有待进一步研究。