固相萃取UPLCMS/MS法测定牛奶中氟虫腈及其代谢物残留量

张小刚，王 霞，马颖清，丰东升，戴春风，陈美莲

(上海市农产品质量安全检测中心，农业部食品质量监督检验测试中心，上海 201708)

氟虫腈(Fipronil)，商品名为锐劲特，是一种苯基吡唑类的广谱杀虫剂，广泛用于农业生产。研究发现，氟虫腈对生态环境具有潜在的危险性，并且具有慢性神经毒性；氟虫腈在动物、植物、环境中会代谢生成与氟虫腈毒性相当或更高的砜化物或亚砜化合物[1]。目前，氟虫腈对环境、生态系统及人类健康的影响受到世界各国的普遍关注，并对其使用及残留量作出明确规定。欧盟和日本规定了牛奶中氟虫腈的残留量限量值分别为0.005和0.02 mg/kg[2-3]。我国农业部第1157号公告规定：除卫生用、部分旱田种子包衣剂外，在中国境内停止销售和使用用于其他方面的含氟虫腈成分的农药制剂[4]。我国《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)也有明确规定，氟虫腈在农作物中的最大残留量为0.1 mg/kg[5]，但尚未对动物源性食品中氟虫腈的最大残留限量作出规定。

目前，氟虫腈及其代谢物的检测方法主要有气相色谱法[6-7]、气相色谱-质谱法[8-9]、液相色谱法[10]和液相色谱-质谱法[11-13]。但是，这些方法多数针对蔬菜水果、环境水体中的氟虫腈及其代谢物残留检测，针对畜禽产品的较少。本文采用乙腈提取，Oasis PRiME HLB固相萃取柱通过式净化，UPLC-MS/MS测定分析，建立一种简便、快速、准确测定牛奶中氟虫腈及其代谢物残留量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛奶 购自超市；氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚标准品 纯度≥96.5%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、丙酮 色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；氯化钠 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水 由Milli-Q纯水机制得。

Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司；MultifugeX1R冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取5 g(精确至0.01 g)牛奶样品于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入20 mL乙腈振荡提取10 min，再加入2 g 氯化钠振摇1 min，8000 r/min冷冻离心5 min。取2 mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液。流出液经0.22 μm有机滤膜过滤至进样瓶中，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；进样体积：2 μL；柱温：40 ℃；流动相A为水，B为乙腈；流速：0.5 mL/min；梯度洗脱程序：0～0.2 min，80%A；0.2～2.5 min，80% A～5% A；2.5～3.0 min，5% A；3.0～3.1 min，5% A～80% A；3.1～5.0 min，80% A。

1.2.3 质谱条件 电喷雾离子(ESI)源；负离子扫描；多反应监测(MRM)；毛细管电压：2.5 kV；锥孔电压：30 V；脱溶剂温度：500 ℃；脱溶剂气流速:800 L/Hr；锥孔气流速：150 L/Hr。离子源温度：150 ℃。质谱采集参数见表1。

表1 氟虫腈及其代谢物的质谱参数Table 1 Parameters for mass spectrometric analysis of fipronil and its metabolites

1.3 数据处理

MassLynxV4.1数据采集分析软件。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的筛选

本实验分别选用甲醇、乙腈、丙酮作为提取试剂，在阴性牛奶样品中添加4种化合物的混合标准溶液，添加水平为5 μg/kg，按本实验建立的方法进行处理分析，结果见图1。结果表明当使用甲醇作为提取剂时，4种化合物的回收率仅为12.4%～35.5%，而当使用乙腈、丙酮作为提取剂时的回收率分别为80.6%～87.5%、82.6%～89.7%，效率相当。由于长期使用丙酮会对反相色谱柱造成不良影响，因此，本实验选用乙腈作为提取剂。

图1 提取溶剂对氟虫腈及其代谢物回收率的影响

2.2 净化条件的筛选

牛奶中含有大量的脂肪、磷脂等物质，这些物质会对目标化合物的检测产生干扰，影响测定的准确性。本研究采用柱通过式净化方式，将2 mL提取溶液加载至Oasis PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液。与常规的反相固相萃取净化相比，整个净化过程省略了活化、平衡、淋洗以及洗脱过程，明显提高了前处理效率。本实验考察了上样量对目标化合物回收率的影响。分别选取1、2、3、4、5 mL不同的上样体积，通过比较平均回收率优化最佳的上样量。实验结果表明，当上样体积为2 mL时，氟虫腈及其代谢物的回收率最高，因此本实验选取2 mL为上样体积。通过比较Oasis PRiME HLB柱净化前后阴性牛奶样品的色谱图(图2)可以看出，Oasis PRiME HLB净化后的牛奶样品基质成分明显减少。

图2 经Oasis PRiME HLB净化前(A)和净化后(B)的阴性牛奶样品的总离子流图

2.3 仪器条件的优化

2.3.1 色谱条件的优化 使用ESI-模式时，通常可采用甲醇-水溶液体系或者乙腈-水溶液体系，也可根据色谱峰形在流动相中加入适量的乙酸铵[14]。本文研究发现甲醇-水和乙腈-水组成的流动相在测定氟虫腈及其代谢物时，都能得到较好的色谱峰形，且乙腈-水溶液体系下目标化合物的响应值要高于甲醇-水溶液体系。故本实验选用乙腈-水作为流动相，氟虫腈及其代谢物的总离子流图见图3。

图3 氟虫腈及其代谢物标准溶液(0.5μg/L)总离子流图

2.3.2 质谱条件的优化 由于氟虫腈及其代谢物在负离子模式下较易失去H+而得到分子离子，所以选择负离子模式进行扫描。分别对0.5 mg/L的氟虫腈及其代谢物标准溶液进行一级质谱全扫描，得到每种化合物的分子离子[M-H]-，然后对其进行二级质谱扫描，优化每种化合物的母离子和子离子所需碰撞能量和锥孔电压，优化后的质谱参数见表1。

2.4 基质效应的评价

基质效应在液质联用分析过程中普遍存在，由于基质效应的影响，目标化合物发生离子增强或抑制作用，从而影响检测结果的准确性。本实验采用(基质匹配标准溶液所作曲线的斜率/无基质标准溶液所作曲线的斜率-1)×100%的方法对氟虫腈及其代谢物进行基质效应评价[15]。通常认为，基质效应在±20%内为不显著[16]。由表2可以看出，氟虫腈及其代谢物均存在一定的基质效应，但均不显著。这也在一定程度上说明本实验所建立的净化方法具有较好的净化效果。为了能更准确的测定目标化合物，本实验采用基质匹配标准曲线进行定量。

表2 氟虫腈及其代谢物的基质效应评价Table 2 Evaluation of matrix effects of fipronil and its metabolites

2.5 线性关系、检出限与定量限

采用阴性样品基质提取液配制浓度为0.05、0.2、0.5、2.0、5.0 μg/L的系列混合标准溶液，以质量浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标作标准曲线，得各目标化合物的线性回归方程和相关系数(r)。结果表明，4种目标化合物在0.05～5.0 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数r为0.9976～0.9997。以3倍和10倍信噪比(S/N)确定各化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)(见表3)。

表3 4种化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 4 compounds

2.6 方法回收率和精密度

为验证本方法的准确度和精密度，取阴性牛奶样品，分别添加3个浓度水平的4种待测物，进行6份平行样品测试，方法回收率和精密度结果见表4。由表4表明，4种化合物在3个加标水平的平均回收率为80.6%～101%，相对标准偏差(RSD)为1.0%～6.1%，均满足《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T 27404-2008)对方法确认技术参数的要求。

表4 4种化合物的平均回收率和相对标准偏差 (n=6)Table 4 Average recoveries and the RSDs of the 4 compounds (n=6)

2.7 实际样品的测定

采用本实验建立的方法对20个牛奶样品进行测定，结果均未检出氟虫腈及其代谢物。

3 结论

本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱测定牛奶样品中氟虫腈及其代谢物残留的技术方法。牛奶样品经乙腈提取，采用通过式固相萃取净化，整体实验操作更简便，耗时更短，适用于高通量样品的筛查。该方法的检出限为0.01 μg/kg，回收率为80.6%～101%，精密度小于10%，满足多残留检测技术的要求，为保障食品安全提供技术支持。