洋甘菊各萃取相抗氧化活性及其有效成分分析

楚秉泉,方若思,李 玲,肖功年,袁海娜,龚金炎

(浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江杭州 310023)

自由基如氧自由基(ROS)导致的蛋白质变性、DNA损伤和脂质过氧化是诱发疾病、加速衰老的重要原因[1-2]。正常情况下,代谢产生的过量自由基可被机体内多种抗氧化防御系统清除,进而预防氧化应激损伤的发生[3]。而当机体处于不良环境或受到如辐射、缺氧、药物、香烟烟雾和光化学空气污染物等作用时,均可能造成大量自由基的产生,威胁人类健康[4]。因此,适当补充抗氧化剂,清除体内过量的自由基,维持机体氧化还原平衡,对疾病防护和人体健康具有很大的益处。

洋甘菊(MatricariarecutitaL.)又称母菊,为菊科甘菊属一年生或多年生草本植物,在德国、东欧、比利时、北美、英国等地区广泛分布,在我国北方和南方也有种植[5],是一种重要的药用植物和香料原料[6],多以其花序或全草入药。洋甘菊甘香味微苦,含有丰富的生物活性物质。从洋甘菊花序中提炼的精油,主要成分为萜类化合物、没药醇、母菊兰烯等,具有消炎、抗过敏、解痉、抑菌、清热、治疗溃疡等功效[7-9];洋甘菊醇提取液富含的酚酸、香豆素类和黄酮类化合物,具有抗氧化、保肝护肝、抗血管增生、消炎、抗变应性和抗病毒等功效[10-11]。但目前研究多集中于洋甘菊水提物或醇提物的功能评价[12-13],少有涉及洋甘菊提取物不同部位的抗氧化活性以及相关化学成分的深入分析研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

洋甘菊 杭州艺福堂茶业有限公司;新绿原酸、绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-葡萄糖、异绿原酸B、异绿原酸C、蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准品(纯度均大于98%) 上海永恒生物科技有限公司;乙腈(色谱纯) 德国Merck公司;DPPH·、ABTS+·、TPTZ、Trolox、NBT、PMS、NADH等 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇、氯化铁、过硫酸钾等 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

BSA124s精密分析天平 赛多利斯(Sartorius)科学仪器(北京)有限公司;KQ-500E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Waterse2695高效液相色谱仪(含自动进样器、柱温箱、2998光电二极管阵列检测器) 美国Waters公司;Eon型酶标仪 美国伯腾(BioTek)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 洋甘菊有效成分的提取 洋甘菊50 ℃烘干后粉碎,过60目筛。准确称取200.0 g洋甘菊粉,用无水乙醇(料液比=1∶10 g/mL)浸泡24 h后,120 W超声提取30 min,抽滤。滤渣用无水乙醇重复超声提取1次。合并滤液,40 ℃减压浓缩至浸膏(无醇味),回收乙醇。浸膏用纯净水重新分散溶解,依次用体积比为1∶1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取4次,即得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和剩余水相。分别40 ℃减压浓缩至干后,-40 ℃冷冻干燥36 h。各冻干物用甲醇配制成相应浓度的待测样本,4 ℃保存备用。

1.2.2 各提取组分的抗氧化活性

1.2.2.1 DPPH·清除实验 用甲醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液,现配现用。取0.1 mL不同质量浓度的待测样本与3.9 mL DPPH·溶液混匀;待测样空白对照组为相应质量浓度待测样本0.1 mL加入3.9 mL甲醇;DPPH·空白对照组为3.9 mL DPPH·加入0.1 mL甲醇。室温下避光反应30 min后,在517 nm波长下测定吸光度值。另以不同质量浓度的VC溶液作为阳性对照[14]。按下列公式计算各样本的DPPH·清除率,并计算各待测样本的半抑制浓度(IC50)。实验重复3次。

DPPH·清除率(%)=[1-(A待测样-A待测样空白对照)/ADPPH·空白对照]×100

1.2.2.2 ABTS+·清除实验 用纯水配制2.45 mmol/L过硫酸钾和7 mmol/L ABTS+·混合溶液。室温下避光静置16 h,制成ABTS+·储备液。临用前用纯水稀释至吸光值为0.700±0.02(734 nm)的ABTS+·工作液。分别取0.1 mL不同质量浓度的待测样本加入3.9 mL的ABTS+·工作液;待测样空白对照组为相应质量浓度待测样本0.1 mL加入3.9 mL的纯水;ABTS+·空白对照组为3.9 mL ABTS+·工作液加入0.1 mL甲醇。混匀后室温下反应6 min,在734 nm波长下测定吸光值。另以不同质量浓度的VC溶液作为阳性对照。按下列公式计算各样本的ABTS+·清除率,并计算各待测样本的半抑制浓度(IC50)[14]。实验重复3次。

ABTS+·清除率(%)=[1-(A待测样-A待测样空白对照)/AABTS·空白对照]×100

1.2.2.4 FRAP法测定还原能力 参考文献[15]方法,略有修改。配制100 mmol/L醋酸缓冲液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液(40 mmol/L盐酸溶液配制)和20 mmol/L氯化铁溶液,按10∶1∶1的比例进行混匀后得RFAP工作液,现配现用。取3.9 mL RFAP工作液,加入0.1 mL 0.5 mg/mL的待测样本(浓度由预实验测得),混合均匀后,在37 ℃的恒温水浴中反应10 min后于593 nm下测定吸光度值,以甲醇为空白对照。结果表达为每克干重相当于Trolox还原力的相当量(mg trolox equivalent antioxidant capacity/g dry weight,mg TEAC/g DW)。实验重复3次。

1.2.3 最佳抗氧化活性组分成分分析 将抗氧化活性最佳的萃取相(乙酸乙酯萃取相)冷冻干燥后用甲醇配制10 mg/mL样本,4 ℃保存备用。

1.2.3.1 总黄酮和总酚的测定 参照文献[16]方法,以芦丁为标准品,亚硝酸钠-硝酸铝显色法(510 nm)建立标准曲线,测定乙酸乙酯萃取相中的总黄酮含量(%);以没食子酸为标准品,福林酚显色法(570 nm)建立标准曲线,测定乙酸乙酯萃取相中的总酚含量(%)。

1.2.3.2 多酚化合物组分分析 用甲醇配制新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草素-7-葡萄糖、异绿原酸B、异绿原酸C、1,3-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准品的混合溶液,4 ℃保存备用。

液相色谱条件及测定方法:色谱柱为Luna-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A:乙腈,流动相B:0.1%磷酸溶液。流速0.8 mL/min,检测波长330 nm,进样量10 μL,柱温35 ℃,梯度洗脱条件见表1。标准曲线法定量待测样本中多酚成分组成。

表1 流动相梯度条件Table 1 HPLC gradient elution conditions

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 洋甘菊醇提物各萃取相的抗氧化活性比较

图1 洋甘菊醇提物不同极性组分对DPPH·的清除作用

图2 洋甘菊醇提物不同极性组分对ABTS+·的清除作用

图3 洋甘菊醇提物不同极性组分对的清除作用 scavenging capacity of different polar fractions of chamomile alcohol extracts

表2 洋甘菊醇提物不同极性组分的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of different polar fractions of chamomile alcohol

2.2 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯组分中总酚和总黄酮含量

多酚和黄酮具有多个酚羟基结构,是天然产物中主要的抗氧化成分之一,具有丰富的药理活性[17-18]。实验采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法(以芦丁为标准品)和福林酚显色法(以没食子酸为标准品)分别对洋甘菊抗氧化活性最强的乙酸乙酯萃取相中的总黄酮和总酚含量进行分析。结果表明,芦丁和没食子酸的标准曲线方程分别为y=0.0761x+0.001(R2=0.9936)和y=0.1852x+0.0057(R2=0.9996),以此标准曲线计算得总酚和总黄酮含量分别为25.84%和14.93%(图4),推测该萃取相较强的抗氧化活性可能与其丰富的酚类和黄酮类化合物有关。

图4 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯组分中总酚和总黄酮含量(n=3)

2.3 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯组分中多酚或黄酮成分分析

进一步采用HPLC法分析乙酸乙酯组分中的多酚或黄酮成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-葡萄糖、异绿原酸B、异绿原酸C、蒙花苷、木犀草素和芹菜素)的含量。通过标准品与样本HPLC图谱中保留时间及各色谱峰的紫外吸收谱吻合度比对(图5),结合外标法对样本中10种多酚或黄酮成分进行定性定量分析,结果如表3所示。10种化合物在洋甘菊中均被检出,采用标准曲线法测定各组分的含量。结果表明,洋甘菊乙酸乙酯组分中木犀草素含量最高,为7.057 mg/g DW,其次是蒙花苷和木犀草素-7-葡萄糖,分别为5.736和5.605 mg/g DW(表3),而这些化合物均被报道具有较好的抗氧化活性[19-21],表明洋甘菊醇提物的乙酸乙酯组分良好的抗氧化能力可能与其丰富的多酚和黄酮有关。

图5 待测样本(A)和混合标准品溶液(B)的HPLC图

表3 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯组分中多酚或黄酮成分及含量

出峰编号化合物出峰时间(min)含量(mg/g DW)1新绿原酸7.4210.295±0.0262绿原酸10.8584.389±0.2843隐绿原酸11.3611.328±0.08841,3-二咖啡酰奎宁酸15.3390.642±0.0535木犀草素-7-葡萄糖24.0295.605±0.3896异绿原酸B29.6611.340±0.0677异绿原酸C40.5343.094±0.1118蒙花苷46.3775.736±0.3459木犀草素48.0817.057±0.62810芹菜素53.7952.467±0.291

3 结论

本实验采用4种抗氧化评价方法，较系统地对比分析了洋甘菊醇提物不同极性(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水相)萃取组分的抗氧化活性,结果发现乙酸乙酯萃取相活性最佳。对乙酸乙酯萃取相中总酚和总黄酮含量进行测定,两种成分分别为25.84%和14.93%,说明洋甘菊是一种富含多酚和黄酮成分的植物;进一步采用HPLC测定了乙酸乙酯萃取相中的10种多酚或黄酮类化合物,表明木犀草素、蒙花苷和木犀草素-7-葡萄糖含量较丰富。

在未来的研究中,我们将进一步明确起主要抗氧化作用的多酚/黄酮类化合物及其量效关系;关于洋甘菊提取物的体内抗氧化功能及其作用机制研究也将在后续的工作中展开。