抗耐药菌β-内酰胺酶抑制剂筛选方法的优化

孙巧云/刘文杰/张新国/赵萍 兰州理工大学 甘肃 兰州 730050

朱建宁 甘肃省食品药品监督管理局审评认证中心 兰州 730070

庞雪茹 岷县职业中等专业技术学校 岷县 748400

细菌感染在临床上很常见，β-内酰胺类抗生素是最常用的抗菌剂[1]。临床所见的耐药菌约80%与β-内酰胺酶的产生有关[2-3] 。以β-内酰胺酶为靶点进行抗耐药菌候选药物的研究仍然是目前阶段一个非常有效的手段[1-4]。β-内酰胺类底物在β-内酰胺酶的作用下生成青霉噻唑酸，可见光下具有不同的特征吸收峰，利用分光光度法可以测算β-内酰胺酶的活性。基于此，我项目组优化前期成功建立的平板快速筛选方法[5]，搭建简单、快速的β-内酰胺酶抑制剂筛选平台，用来快速发现对其有效的抗生素或酶抑制剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青霉素V钾 阿拉丁试剂有限公司；β-内酰胺酶标品 上海晶纯实业有限公司；他唑巴坦(tazobactam) 含量≥98%，阿拉丁试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；pH计(pH-902) 泰州市正大科教仪器设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

PBS缓冲液：称取Na2HPO420.66 g，NaH2PO46.59 g溶于100 mL双蒸水中，调节pH为7.0；待测物溶液：将待测物溶于无水PBS中，浓度为1 mg/mL。碘化物：称取碘2 g，碘化钾85.1 g溶于100mL PBS，储存在棕色瓶中。淀粉-碘化物[7] ：称取0.2 g淀粉溶解于100 mL PBS（0.1 mol/L）中，煮沸2 min，至澄清，然后冷却至室温。将150 μL碘化物加入100 mL 淀粉溶液，备用。

1.2.2 底物最佳检测波长的确定

向1.6 mL淀粉-碘化钾溶液中加入0.02 mg/mL青霉素V钾1 mL和0.4 mL PBS缓冲液，在190-990 nm波长范围内，对样品液进行全波长扫描，确定底物的最佳吸收波长。

1.2.3 最适青霉素V钾浓度的确定

实验选取青霉素V钾为底物。维持反应总体积加量不变，取1.6 mL碘-淀粉溶液和400 μL PBS缓冲液于试管中，依次加入1.0 mL，0.02 mg/mL、0.07 mg/mL、0.12 mg/mL、0.17 mg/mL、0.22mg/mL、0.27 mg/mL青霉素V钾，在571 nm处每10 s测定一次吸光值，共测定300 s，以确定青霉素V钾的最适浓度。

1.2.4 最适β-内酰胺酶浓度的确定

取1.6 mL碘-淀粉溶液，1.0 mL青霉素V钾和300 μL PBS缓冲液于试管中，分别加入100uL，20U/mL、70 U/mL、120 U/mL、170 U/mL、220 U/mL、270 U/mL β-内酰胺酶。同1.2.3所示进行测定，以确定β-内酰胺酶的最适浓度。

1.2.5 最适阳性药物浓度的确定

取1.6 mL碘-淀粉、1 mL青霉素V钾和100μL酶于试管中，分别加入300 μL，0.002 mg/mL、0.006 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.08 mg/mL对照品，依照1.2.3所述方法计算不同浓度的抑制率，确定抑制剂的最适浓度。

1.2.6 β-内酰胺酶筛选平台的验证及抑制剂的筛选

确定最佳条件后，对1.2.5所示体系，平行试验三次，根据直线斜率的变化计算化合物的抑制活性，公式如下：

对实验室之前保藏的200个植物内生真菌，采用1.2.5建立的方法进行筛选。

2 结果与分析

2.1 底物最佳检测波长的确定

在190-990 nm波长范围内，在571 nm显示最大吸收峰值，具有较高吸收度和精确性，因此，571 nm可以作为β-内酰胺酶抑制剂活性检测的最适波长。

图1 底物溶液全波长扫描结果

2.2 最适青霉素V钾浓度的确定

随着青霉素V钾浓度的增大，体系的降解速率增大（表1）。青霉素V钾浓度0.02 mg/mL时，几乎没有降解且判定系数R2最高，达到0.9996，呈现非常高的相关性。故选取青霉素V钾浓度为0.02 mg/mL。

表1 不同浓度的青霉素V钾的紫外测试结果

2.3 最适β-内酰胺酶浓度的确定

不同浓度的β-内酰胺酶，对反应体系影响显著。随着酶浓度的增大，酶促反应初速率呈现先升高后平缓的趋势（表2）。在酶浓度为20 U/mL，虽然反应初期线性关系较好，但是酶促反应速度只达到0.0189 mmol·min-1。在酶浓度为70 U/mL，酶反应初速率达到最高值0.0482 mmol·min-1，且判定系数R2达到0.9804。故选取酶浓度为70 U/mL。

表2 不同浓度的β-内酰胺酶的紫外测试结果

2.4 最适阳性药物浓度的确定

由表3可知，随着抑制剂浓度的增大，抑制率先增大后趋于平缓。当抑制剂浓度大于0.03 mg/mL，各组抑制率接近。考虑实验成本，故选择抑制剂浓度为0.03 mg/mL。

表3 不同浓度阳性药物的紫外测试结果

2.5 β-内酰胺酶筛选平台的验证及抑制剂的筛选

对β-内酰胺酶抑制剂筛选平台进行三次平行验证，三次的抑制剂率分别为82.0%，80.8%，81.7%，几乎无差别且R2分别为0.9955，0.9959，0.9954，较好的相关性，证明了筛选平台的稳定。随后对200个备用的发酵液进行筛选。抑制率低于60%有181个，60% ～ 90% 有17个；90%以上有2个。筛选得到2个对β-内酰胺酶具有高抑制活性的样品。

3 结论

确定筛选平台最佳方案为：最大吸收波长为571 nm，青霉素V钾浓度为0.02 mg/mL，酶浓度为70 U/mL，他唑巴坦浓度为0.03 mg/mL。