东北地区狐源大肠杆菌耐药性的检测

安富宇,杨金雨,冯 涛,刘伟石,薛 原

(1.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江 哈尔滨 150069)

由于抗菌药物的大范围使用,细菌的耐药水平愈发增高和耐药谱愈发扩大,导致耐药水平增加,甚至超级细菌的出现,使动物疾病的防治面临严峻挑战。目前已成为影响养殖业正常发展的主要因素之一。同时,大肠杆菌由于广泛存在于动物体内环境中,是细菌耐药基因储存库和重要传播中转站,国际上将其确定为耐药性检测的标定菌株[1]。已报道感染大肠杆菌病的野生哺乳动物包括：犬、狐狸、水貂、毛丝鼠、鹿、刺猬、虎等。本试验以东北地区的狐源性大肠杆菌为研究对象,进行了有关耐药性的测定。探究大肠杆菌在东北地区狐狸养殖场的流行情况,从而为狐狸养殖及正确使用抗菌药提供依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 药敏质控菌株大肠杆菌 ATCC 25922,购自中国兽医药品监察所。124株大肠杆菌是2016年6-12月从黑龙江、吉林、辽宁的狐狸养殖场分离所得临床菌株。各个分离菌株用于后期的药敏试验。

1.2 培养基 普通琼脂和水解酪蛋白琼脂培养基(Mueller-Hinton,MH),购自杭州天和微生物试剂有限公司,批号为151023。

1.3 药敏纸片 共22种药敏纸片,均购自杭州天和微生物试剂有限公司和 OXIOD公司。包括 β-内酰胺类：阿莫西林/克拉维酸钾(AMC)、阿莫西林(AMX)、氨苄西林(AMP)、氨曲南(ATM)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻吩(KF)、亚胺培南(IPM);氨基糖苷类：阿米卡星(AK)、庆大霉素(CN)、卡那霉素(K)、新霉素(NEO)、安普霉素(APR);喹诺酮类：诺氟沙星(NOR)、恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX);四环素类：强力霉素(DO)、四环素(TE);磺胺类：复方新诺明(SXT);氯霉素类：氯霉素(C)、氟苯尼考(FFC);多肽类：多黏菌素PB。

1.4 方法

1.4.1 药敏试验 采用WHO提倡的Kirby-Bauer法[2]。依据CLSI有关标准,只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才具有科学有效性。

1.4.2 判定标准 按抗菌药物敏感性试纸片扩散法标准[3]判定各菌株的敏感度,对所分离的细菌进行药敏试验。以敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐药(Resistant)3种程度来对抑菌圈大小作出判定。

2 结果

2.1 大肠杆菌的耐药性 124株狐源大肠杆菌均可产生耐药性。对氨苄西林、头孢噻吩、卡那霉素、四环素、氯霉素、强力霉素和复方新诺明的耐药率均在60%以上;对阿米卡星、多黏菌素B敏感率在80%以上,而对亚胺培南敏感率在90%以上,见表1。

2.2 大肠杆菌的多重耐药性 124株受试狐源大肠杆菌对22种抗菌药物均存在耐药性。10耐菌株所占比例最大为21.6%。分离菌株存在耐药现象,最多为18种,见图1。

表1 狐源性大肠杆菌对22种抗微生物药的体外药敏试验结果 /%

图1 狐源性大肠杆菌的耐药性

3 讨论

由于抗菌药普遍应用,细菌出现耐药性变异的情况愈发增多。目前国内大肠杆菌耐药性的复杂与严重愈发突出,并大量出现了对多种抗生素抵抗耐药的现象。狐狸等毛皮动物多种耐药性菌株的生成与抗生素的普遍应用相关,使用亚治疗剂量的抗菌药易导致耐药性菌株的出现[4]。狐源性大肠杆菌出现多种耐药的情况,这和狐狸养殖场的不合理使用抗菌药物有关。

124株受试狐源大肠杆菌对22种抗菌药物均存在耐药性。10耐菌株所占比例最大为21.6%。分离菌株存在1～18耐药现象,最多为18种。124种耐药大肠杆菌中耐8种抗生素的比例占12%。对四环素、氨苄西林、链霉素、恩诺沙星 、氧氟沙星的耐药率较高。这与孙玉国等报道相似[5]。另外Brien O T F也有报道耐药质粒可以将大肠杆菌的耐药基因通过转化、转导和结合方式在菌间相互转移,从而使大肠杆菌的耐药性迅速传播,这也是在养殖场中的畜禽出现耐药性的原因之一[6]。大肠杆菌的耐药性机制有：(1)抗生素作用位点的改变或新作用位点的发生;(2)酶对抗生素的修饰和破坏;(3)增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用;(4)细菌外膜通透性的改变;(5)质粒介导的耐药性。一种耐药机制可以对多种抗生素表现为抗性,同一种抗生素也常常出现多种耐药性机制共同抑制的现象[7]。

2002中国已经禁止氯霉素用于食品动物,但试验中却出现高达60.8%的检测菌株对氯霉素耐药,这一方面可能是这个耐药表型的流行可能与携带cmlA基因的质粒广泛传播相关[8]。另一方面可能从养殖场的不合理用药导致。敏感的药物严格按说明足量足疗程使用或根据药物的配伍禁忌联合用药;一方面可以使抗菌药之间的协同作用表现出来,增加疗效;另一方面可以防止细菌长时间和某种药物作用,增加产生耐药性机率[9]。在临床用药或在饲料添加药物时,应该尽量不要长期使用同几种药物,从而减少细菌耐药性的发生,保障养殖业的健康发展。