干热河谷地区芒果炭疽病菌生物学特性①

杨子祥 苏银玲 白明第 刘海刚 木万福 段元杰 杨玉皎 方海东

(云南省农业科学院热区生态农业研究所/元谋干热河谷植物园 云南元谋 651300)

芒果是著名的热带水果之一，也是云南热区的支柱产业之一[1]。云南芒果适栽区大都分布于金沙江、元江、怒江、南盘江等沿江的低海拔干热河谷地区，气候干热、少雨，阳光充足，气温高，昼夜温差大，小环境类型多，芒果品种多样、品质优良，口味佳，深受人们喜爱[2]。但近年来，随着芒果栽培面积的不断扩大，其病害问题日益突出，严重影响了芒果的产量和品质。其中，由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的芒果炭疽病已发展为区域种植中的重要病害之一[3-6]。芒果炭疽病具有潜伏侵染性，主要危害果实，是果实采收后危害最严重的病害之一，占果实病害总量的70%以上，常引起贮运期的果实腐烂，造成严重的经济损失[7]。目前，国内外对芒果的研究多集中于芒果的栽培、新品种的选育、病害的识别和防治等方面，但对芒果炭疽病病原真菌的生物学特性研究甚少。因此，本研究采用菌丝生长速率法、血球计数板法，就不同环境条件对胶孢炭疽菌菌丝生长和孢子形成的影响开展研究，以期对芒果炭疽病的综合防治提出相对合理、 科学的防控措施，为进一步推进云南芒果产业的持续、快速发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，采自云南干热河谷地区芒果园炭疽病病叶，经分离获纯化后，于4℃冰箱中保存备用。培养基采用马铃薯琼脂葡萄糖培养基(PDA)，其中马铃薯200 g、葡萄糖17～20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1 000 mL[8]。

1.2 方法[9-12]

1.2.1 温度对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

挑取菌龄一致，直径为7 mm的菌饼接种于PDA平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35和40℃恒温培养箱中倒置培养，每处理3次重复，6 d后采用十字交叉法测量菌落直径，10 d后每个培养皿加入10 mL无菌水洗下孢子，在显微镜下用血球计数板法测定各梯度产孢量。

1.2.2 光照对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

挑取菌龄一致，直径为7 mm的菌饼接种于PDA平板中央，分别置于12 h光照/12 h黑暗、24 h全光照、24 h全黑暗的条件下，26℃恒温培养箱中倒置培养，其余方法同1.2.1。

1.2.3 pH值对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

用1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L HCl调节灭菌后PDA培养基，制成pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的培养基。将菌龄一致，直径为7 mm的菌饼接种于各pH值PDA平板中央，26℃恒温培养箱中倒置培养，其余方法同1.2.1。

1.2.4 不同碳源对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

以查氏培养基为基础培养，分别用等摩尔碳量的淀粉、甘油、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇替代蔗糖，以无碳源培养基为对照，将菌龄一致，直径为7 mm的菌饼移入含有不同碳源培养基上，26℃恒温培养箱中倒置培养，其余方法同1.2.1。

1.2.5 不同氮源对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

以查氏培养基为基础培养，分别用等摩尔氮量的硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和尿素替代硝酸钠，以无氮源培养基为对照，将菌龄一致，直径为7 mm的菌饼移入含有不同氮源培养基上，26℃恒温培养箱中倒置培养，其余方法同1.2.1。

1.2.6 菌丝和分生孢子致死温度测定

取10 mL菌丝体悬浮液或10 mL孢子悬浮液(400倍镜下50～100个孢子/视野)于灭菌试管中，置于40、45、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59 和60℃的恒温水浴锅中，处理10 min后迅速冷却。将菌丝体悬浮液或孢子悬浮液涂于PDA平板上培养，6 d后观察菌丝、菌落生长状况。

1.2.7 数据统计与分析

利用Excel 2007和DPS软件进行数据统计，采用Duncan's法进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 温度对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

由图1可知，在10～25℃内菌丝生长速率随着温度升高而增大，25℃时菌落直径达80.80 mm，在30℃时，菌丝生长速率下降，40℃时停止生长；病原菌产孢量在10～25℃时逐渐升高，25℃时的产孢量最大，为102.40×106个/mL。说明芒果炭疽菌菌丝生长和孢子形成的温度均为10～35℃，适温分别为15～25℃及20～25℃。相对而言，分生孢子形成的最适温度略高于菌丝生长的最适温度。

2.2 光照对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

图1 不同温度对病原菌菌丝生长及产孢的影响

芒果炭疽病菌在不同光照条件下均能生长，光照可促进芒果炭疽菌的菌丝生长，其中24 h全光照菌落直径最大，达79.70 mm，12 h光照/12 h黑暗次之。光照对该菌孢子的形成有显著促进作用，其中，以12 h光照/12 h黑暗促进作用最明显，102.60×106个/mL(表1)。此外，光暗交替处理的菌落还会出现粉红色与灰白色菌丝相间构成同心轮纹。

表1 不同光照对菌丝生长及产孢的影响

2.3 pH值对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

图2表明，在不同pH值PDA培养基上芒果炭疽病菌菌丝能在较宽的pH值范围内生长。在pH为4～8时，菌丝生长速率逐渐增快，pH为7时菌落最大，直径达80.70 mm，之后随着pH升高，菌丝生长速率下降，当pH为2时菌丝不能生长。芒果炭疽病病原菌在pH 3～10的范围内均能形成分生孢子，分生孢子形成最佳pH值为4，此时孢子量高达860.00×106个孢子/mL，之后随着pH升高，产孢量下降。上述结果表明，偏酸性至中性条件有利于芒果炭疽病菌菌丝生长，且在酸性条件下有利于分生孢子形成。

2.4 不同碳、氮源对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响

由表2可知，芒果炭疽病菌对麦芽糖的利用率最高，培养6 d后菌落直径达80.00 mm；在无碳源的培养基上菌丝虽然生长较快，但菌丝稀疏，病原菌对其它碳源利用高低依次为淀粉＞蔗糖＞甘油＞甘露醇＞果糖。麦芽糖为碳源的培养基上，不仅菌丝生长迅速、孢子形成量也最高，为48.20×106个/mL，而甘露醇不利于该菌产孢，仅为5.40×106个/mL。

从表3可知，牛肉膏为芒果炭疽病菌适宜氮源，培养6 d后菌落直径达83.50 mm，极显著高于其它氮源处理的菌落大小；菌丝在硫酸铵和尿素为氮源的培养基上生长速度缓慢，菌落直径均为25.67 mm；说明病菌对氮源利用高低依次是牛肉膏＞蛋白胨＞酵母膏＞硝酸钠＞硝酸钾＞硫酸铵＝尿素。牛肉膏为碳源对孢子的形成较好，硝酸钾、硫酸铵对孢子的形成相对较差，蛋白胨和尿素为氮源不产生孢子不利于产孢。

图2 不同pH对病原菌菌丝生长及产孢的影响

表2 不同碳源对菌丝生长及分生孢子形成的影响

表3 不同氮源对菌丝生长和孢子形成的影响

2.5 菌丝和分生孢子致死温度测定

试验中通过设置不同温度梯度，测定了芒果炭疽病菌丝和分生孢子的致死温度。结果表明，芒果炭疽病菌丝致死温度为56℃，10 min；分生孢子的致死温度为51℃，10 min(表4)。

表4 菌丝和分生孢子的致死温度

3 讨论

云南干热河谷地区芒果生产中炭疽病严重危害叶片和果实，特别是在芒果果实生长期间普遍存在着炭疽病菌的潜伏侵染，而且带菌率高。本研究就不同温度、光照、pH值、营养等环境因素对芒果炭疽病菌菌丝生长和孢子形成的影响进行了对比分析。初步研究表明，芒果炭疽病菌10～35℃范围内均可生长，其菌丝生长和孢子形成的最适温度为25℃，在20℃以下或30℃以上该菌菌丝生长速度和产孢量明显减少，分生孢子形成的最适温度略高于菌丝生长的最适温度。这些特性与芒果炭疽病每年在田间的消长规律关系密切。云南干热河谷地区芒果炭疽病在1年内有多个发病高峰，一般年份春、夏梢发病重，秋梢发病轻。但如果8月遇阴雨天气，则可能发生第3次高峰期，秋梢也会严重感病。芒果炭疽病菌对酸碱度的适应能力强，pH为3～10的范围内菌丝均能生长和产孢，病菌丝生长最佳pH为7，分生孢子形成最佳pH值为4，说明偏酸性至中性条件有利于病菌菌丝生长，在酸性条件下有利于分生孢子形成。这与黄思良等[13]对芒果炭疽病菌的生物学特性的研究结果基本一致，但略有差异，这可能与寄主及病原菌生长环境差异有关。24 h光照条件下有利于菌丝生长，而12 h光照/12 h黑暗可促进其产孢，与刘爱媛等[14]对荔枝胶孢炭疽菌的研究结果之间有一定差异，这可能与炭疽病菌在不同种类植物上寄生或变异有关，需要进一步研究证实。以麦芽糖为碳源和以牛肉膏为氮源时病原菌菌丝生长最快、产孢量最大，说明芒果炭疽病菌的生长需要碳氮源。芒果炭疽病菌菌丝对高温的耐受能力比分生孢子强，病菌丝致死温度为56℃，10 min；分生孢子的致死温度为51℃，10 min。本研究结果可为在芒果果实上应用热处理措施控制炭疽病选择处理温度和时间提供参考。关于不同的热处理方法、温度、时间对芒果果皮中炭疽病菌活力的抑制作用还需进一步研究[15]。因此，在芒果炭疽病蔓延时期，防治时要采取不同措施，错开病原菌生长发育的最适环境条件防止芒果炭疽病的发生，如选择高地建园，沟系畅通，科学施肥，合理修剪，改善果园土壤环境等。

近年来，由于芒果种植效益突出，管理较其他水果简单，农民种植芒果的积极性比较高，种植区域不断扩大，接踵而来的病害日益蔓延，越发严重。因此，本研究为芒果炭疽病菌分子生物学、病原学、病理学的新发现提供理论基础，对今后该病的发生与防治有着深刻的指导和现实意义，为芒果炭疽病防治提供理论依据。随着分子生物学的快速发展，本试验运用传统的实验方法进行研究，可能存在很多方面的不足，所以，今后对该病原菌的生物学特性和致病机理等方面的问题，应采用分子生物学的方法作进一步的试验研究，以便促进芒果产业绿色无公害的快速发展。