一种低毒透明剂制作植物叶片石蜡切片的方法①

李亚男 严 炜 罗丽娟 吕玉兰 黄家雄③

(1云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所 云南保山 678000；2海南大学 海南海口 570228)

在植物发育生物学、组织学研究中石蜡切片技术有着十分重要的角色，并在研究植物组织结构中有着重要的意义，该技术利用植物的组织与石蜡能够很好结合的基本原理，通过标本的采集→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→贴片→烘片→脱蜡→染色→脱水→透明等一系列特殊的方法制成透明的薄片，在光学显微镜下观察，可以清晰如实地反映机体的形态变化和结构特征，并且能定量测定样品中组织结构的大小、数量等。同时还能观察机体在不同实验条件下的结构以及所含物质的变化，进而了解组织细胞的分化、活动以及细胞间的相互关系等[1-3]。

传统的石蜡切片是利用二甲苯作为透明剂，其气味刺激难闻，是易挥发的可疑致癌物，毒性较大。它能通过皮肤粘膜和呼吸道进入人体，损害人体的神经和血液系统，给制片工作者的身体健康构成了潜在危险[4-5]。再则石蜡切片程序较复杂、烦琐，耗时且不易制作出好的切片。因而改良石蜡切片技术一直是学者关注的重要问题。近年来，在石蜡技术改进方面很多学者做了相关的研究与探索，其中包括透明和脱蜡技术的改良、植物制片多重整体染色技术的研究、包埋和修蜡过程的改进等[6-11]。但在低毒、快速的关键性问题上还未曾有突破性的报道，尤其是关于选用天然低毒有机溶剂作为透明剂的研究鲜见报道。在制作石蜡切片技术上，国外普遍采用环保产品van-clear的做法也偶有报道，van-clear环保透明剂是一种新型合成的、专门为组织病理学和细胞学样品处理设计的无色、无味的有机溶剂，不含苯，是从国外引进的是一种环保的二甲苯替代物，在医学领域主要用于病理组织脱水及染色过程中，对生物组织中的蛋白、核酸无影响，在植物组织切片中用于组织透明与脱蜡，无毒性[6]。其操作程序却无详细的介绍，初学者不便于采用。另外，传统石蜡切片技术中的脱水、包埋、展片、贴片、烘片及染色等步骤还有可简化的空间。

针对以上问题，本研究将通过大量摸索实验，对传统石蜡切片技术的不足之处进行合理的改良，并详细介绍技术的操作流程，为初学者准确把握该技术，同时能提高植物石蜡制片的质量、缩短制片周期和减少有毒物质提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为禾本科(Gramineae)植物狗牙根(Cynodon dactylon)叶片，主要取其直立枝完全展开的倒数第三片叶，在其中部切下0.5 cm长叶段。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与固定

采集新鲜材料固定于70%乙醇浓度的FAA混合固定液(体积比 福尔马林∶冰醋酸∶70%乙醇＝5∶5∶90)中。真空抽气15～20 min迅速杀死细胞，防止细胞自溶，保存完整的细胞结构，放置于4℃冰箱备用。

1.2.2 脱水与透明

材料固定24 h后可进行脱水，脱水过程为：70%乙醇(1 h)→85%乙醇(1 h)→95%乙醇(1 h)→95%乙醇(1 h)→100%乙醇Ⅰ(1 h)→100%乙醇Ⅱ(1 h)。并将脱水容器放置在摇床上进行，使材料充分均匀脱水。

透明过程分别用二甲苯及van-clear剂处理，过程如下：

van-clear剂：无水乙醇与van-clear剂混合液(1:1体积比混合，0.5 h)→van-clear剂Ⅰ(1 h)→van-clear剂Ⅱ(0.5 h)，注意透明时间不宜过长，这样会使组织变硬发脆，切片会造成植物组织出现裂痕。

二甲苯：无水乙醇与二甲苯混合液(1:1体积比混合，0.5 h)→纯二甲苯(1 h)→纯二甲苯(0.5 h)，此步骤需在通风橱中进行。

1.2.3 浸蜡与包埋

van-clear剂：选用熔点为52～56℃的石蜡浸蜡，并于55℃下完成浸蜡。过程为van-clear剂与纯石蜡Ⅰ混合液(1∶1体积比混合，恒温箱设置温度为37℃，过夜浸蜡，时间为15 h，盖上浸蜡容器盖子)→纯石蜡Ⅱ(恒温箱设置温度为50℃，时间为2 h，盖上浸蜡容器盖子)→纯石蜡Ⅲ(恒温箱设置温度为52℃，时间为1 h，打开浸蜡容器盖子)→石蜡Ⅳ(恒温箱设置温度为54℃，时间为5.5 h，打开浸蜡容器盖子)。

二甲苯：选用的石蜡熔点同上。向有二甲苯的材料中加入纯石蜡(小刀切碎的碎蜡)，然后放入37℃恒温箱2 d(容器要有盖子盖住)，其间不断加入碎蜡(可早晚各添加1次)，如容器内已满就倒出些液体再加。第三天将温箱温度上升至59℃，放置6 h，换纯石蜡2次，每次分别为3 h。

浸蜡结束后便立即包埋材料，将蜡液渗入包埋盒中并平置于湿毛巾上降温，待底层蜡液稍有凝固后迅速将材料移入包埋盒中，并用镊子摆好横切面位置，1个包埋块内根据材料大小放入3～4片样品。将纸盒平放在冷水中，使熔蜡凝固成蜡块。待石蜡完全凝固(约30 min)后即可取出备用。

上述步骤(包括固定、脱水、透明、浸蜡)中均需要拧紧盖子，防止空气中水分进入及透明剂挥发。

1.2.4 切片、展片

切片使用手动旋转切片机，切片机的厚度控制在10～12μm。调整切片机刀刃与蜡块表面成5°夹角。将蜡带放入40℃蒸馏水中展片，使蜡带放在玻片的中心。展片后在载玻片上编好记号，将载玻片放在37℃温箱中烘干12 h后存放于切片盒中，待染色。

1.2.5 脱蜡复水及染色

van-clear剂：烘干后的切片用van-clear剂脱蜡2次，脱蜡依次为，van-clea剂(15 min，试剂可重复使用)→纯van-clear剂(20 min，试剂不可重复使用)；逐级用乙醇复水，即放入100%→95%→85%→70%→50%各级乙醇溶液中各5 min；随后将切片放入1%番红水溶液(用95%乙醇溶液配制)染色2～4 h；再放入50%→70%→85%→95%乙醇溶液中洗去多余红色，随后用1%的固绿(用95%乙醇溶液配制)染色10～40 s；固绿染色之后再继续脱水和透明，即95%乙醇→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→van-clear剂Ⅰ→van-clear剂Ⅱ，每步约5 min；最后用浓度适中的加拿大树胶或中性树胶封片；封片后，将切片放于37℃温箱烘干。永久保存。

二甲苯：脱蜡依次为二甲苯(15 min，试剂可重复使用)→纯二甲苯(20 min，试剂不可重复使用)。逐级用乙醇复水，染色步骤同上，染色完成后继续脱水和透明，95%乙醇→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→无水乙醇与二甲苯混合液(混合比例1:1)→纯二甲苯，每步约5 min。此步骤需在通风橱中进行。

1.2.6 观察、拍照

切片制好后用Nikon Eclipse 80i生物显微镜进行观察，并以形态分析软件进行一定处理。

2 结果与分析

2.1 van-clear剂作为透明与脱蜡剂切片展示

如图1、2所示，利用van-clear剂制成的切片，切片厚度较均匀，叶片组织结构清晰，细胞结构完整。而且不用在通风橱操作透明与脱蜡过程，步骤简易，降低二甲苯对实验人员的伤害，van-clear剂是一种较为理想的二甲苯替代物。

2.2 van-clear剂作为透明与脱蜡剂优点

使用van-clear剂的石蜡切片方法较二甲苯方法耗时短，即第一天开始采集样品及固定，第二天开展脱水与透明，然后依次进行浸蜡与包埋，到第3天晚上就能完成切片、贴片及烘片，第4天完成番红—固绿溶液染色及封片，烘干后可以用显微镜观察。综合以上步骤，用此法制作石蜡切片的需要耗时4天，并且，在烘片期间，还可以重复以上步骤，开展新一轮的石蜡切片制作。

图2 普通狗牙根叶片横切面显微结构(二甲苯作为透明剂与脱蜡剂)

3 讨论

制作植物叶片石蜡切片，利用van-clear剂取代二甲苯作为透明剂和脱蜡剂，可以避免传统透明剂二甲苯对实验人员的危害。在试验中，对于同一种样品van-clear剂与二甲苯所用的时间均不同，需要经过不断的试验来掌握最佳的时间，对于不同样品的不同材质，使用van-clear剂作为透明剂与脱蜡剂所需要的时间也不相同，要根据组织的密度、气温、切片的厚度等来决定，这需要在试验中不断的摸索与求证。

另外处理材料用van-clear剂，不仅透明效果较好，还可使组织结构浸蜡充分，容易连续切片，脱蜡快速干净，保持完整的组织结构。同时按照这一方法进行石蜡切片制作，可以节省大部分的实验时间。综合上述，van-clear剂可以作为一种相对安全有效的二甲苯替代物运用在制作石蜡切片中，在这一改进方法中，各个操作步骤衔接紧密，并根据实验目的和材料的不同，操作方法进行了适当调整，既节省了材料、时间以及人力，又保证了制片质量，可应用于植物组织切片中。