真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析*

刘冉阳 史成银 谢国驷 李 晨 王海波

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出 过程功能实验室 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室 青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室 青岛 266071；2.上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306)

近年来，随着石斑鱼人工杂交苗种繁育技术的进步，且杂交子代存在明显的杂交优势，杂交石斑鱼逐渐 成 为 市场的新宠(李 炎璐等,2015; 邵彦翔 等 ,2017)。褐龙斑是褐石斑鱼(Epinephelus bruneus♀)与鞍带石斑鱼(E.lanceolatus♂)的杂交子代，存在明显的杂交优势，是具有较大养殖潜力的石斑鱼新品种。由于规模化养殖时间较短，目前国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年 7月，山东省某养殖场褐龙斑出现急性、大量死亡。调查褐龙斑发病情况，取濒死鱼的组织进行电镜切片观察，在病鱼脾、肾等组织内发现大量的虹彩病毒样颗粒。

虹彩病毒是20面体状的大型DNA病毒，共分为5个病毒属，其中，肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)的虹彩病毒是鱼类的重要病原之一(Jancovichet al,2012)。依据病毒的主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因，细胞肿大病毒属虹彩病毒可分类为 3大类群(基因型)，即主要感染海水鱼类的真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV)类群、主要感染淡水鱼类的传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)类群和主要感染鲆鲽鱼类的大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)类群(Fuet al,2011; Kuritaet al,2012)。真鲷虹彩病毒能导致多种鱼类发病死亡，严重威胁着世界鱼类养殖业的发展(Inouyeet al,1992)。因此，真鲷虹彩病毒病长期以来被世界动物卫生组织(OIE)和中国列为鱼类重要疫病(Junget al,2000; Rodgeet al,1997; Wenget al,2002; Chuaet al,1994)。

本研究通过疾病调查、病鱼的临床检查、组织病理和超微病理观察、病原初步筛查和分子生物学鉴定，确认感染褐龙斑的病毒为真鲷虹彩病毒，可为该病的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

发病濒死和健康的褐龙斑均取自山东省某石斑鱼养殖场。TSA、TCBS培养基购自北京陆桥生物制品有限公司，海洋动物组织DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker购自TaKaRa公司；所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 疾病调查与临床检查

调查养殖环境及病鱼死亡情况；观察病鱼活动情况，对濒死病鱼进行观察和剖检。

1.3 组织病理及超微病理观察

参照史成银(2004)的方法，取濒死病鱼和健康鱼的肝、脾、肾、头肾、鳃、心脏、胃和肠道组织制成石蜡切片和超薄电镜切片，利用光学、透射电子显微镜观察拍照。

1.4 寄生虫观察和细菌分离

取濒死病鱼的鳃丝、体表黏液制成水浸压片，显微镜下观察。使用病鱼的肝、肾、脾接种TSA和TCBS平板后，28℃培养48 h，观察细菌生长情况，进行细菌检测。

1.5 组织DNA提取和PCR检测

提取濒死病鱼脾、肝、头肾和肾组织的 DNA，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《真鲷虹彩病毒病检疫技术规范》(SN/T 1675-2014)，使用引物1-F/1-R和4-F/4-R进行PCR检测(表1)。50 µl的 PCR 反应体系：10×Reaction buffer(含 20 mmol/L Mg2+) 5 µl，2.5 mmol/L dNTPs 4 µl，20µmol/L引物各1µl，5 U/µlTaq酶 1 µl，100 ng/µl的模板 DNA 4 µl，补足超纯水至 50 µl。PCR 反应程序：95℃预变性 2 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，共进行 30个循环；最后72℃延伸5 min。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果。

表1 本研究中的PCR引物序列及其目标产物大小Tab.1 Sequences of PCR primers and products length in this study

1.6 虹彩病毒MCP全长基因的扩增

参照史成银(2004)，用引物 MCP-iridoF和MCP-iridoR 扩增 MCP 基因全长(表1)。50 µl的 PCR反应体系：10×Reaction buffer (含 20 mmol/L Mg2+) 5 µl，2.5 mmol/L dNTPs 4 µl，20 µmol/L引物各1µl，5 U/µlTaq酶 1 µl，100 ng/µl的模板 DNA 4 µl，补足超纯水至 50 µl。PCR 反应程序：94℃预变性 5 min；94℃ 2 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；最后，72℃延伸5 min。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查结果。PCR产物由上海生工生物技术有限公司从两端单向测通，再拼接出完整的PCR产物序列，用Blast比对分析测序结果。

1.7 虹彩病毒的系统发育分析

依据Blast比对结果，选取18种(株)具有代表性的虹彩病毒，从GenBank下载各病毒的MCP基因全长序列，用MEGA 7.0构建虹彩病毒系统发育树，分析、鉴定感染褐龙斑的病毒在虹彩病毒科中的分类地位。各病毒的名称及GenBank登录号为：ATV (NC_ 005832)、CIV (AF303741)、FLIV-JJY (AY633990)、FV3 (U36913)、GIV (AY666015)、IIV-3 (DQ643392)、ISKNV (NC_003494)、ISKNV SB04 (KY440040)、LCDV-1 (NC_001824)、LCDV-C (AY380826)、RSIV-1 (AB666328)、RSIV 2HSB (AB666318)、RSIV-8 (AB666335)、RSIV-9 (AB666336)、RSIV 10GG (AB666324)、RSIV Ehime-1 (AB080362)、RSIV TGA14 (AB666320)、TRBIV (GQ273492)。

2 结果

2.1 疾病调查与临床检查

褐龙斑以循环水工厂化养殖，发病时的水温为28℃、盐度为31、pH为7.5、溶氧为4.5 mg/L、养殖密度为1000尾/40 m3。发病初期，病鱼活力明显下降。随病程发展，病鱼反应迟钝、伏底，并出现死亡。4个发病池，日死亡率约10%，10 d内累积死亡率达80%。

病鱼为2龄鱼，全长为29.5～31.5 cm，体重约为500 g。多数鱼体表未见明显异常，个别鱼尾鳍有溃疡病灶。病鱼鳃丝鲜红，无溃烂(图1A)。解剖可见病鱼空肠空胃，无明显发炎。肝局部出血，呈现不均匀的颜色。脾和肾严重肿大、易碎，肾脏色淡(图1B)。

2.2 组织病理观察

图1 患病褐龙斑Fig.1 Diseased fish

图2 患病鱼组织病理变化(标尺为 20 µm)Fig.2 Histopathological changes in the diseased fish (Bar=20 µm)

健康鱼脾实质细胞饱满、清晰、排列紧密(图2A)。病鱼脾组织细胞坏死，被大量红细胞浸润，出现严重淤血。组织中填充有大量嗜碱性的肿大细胞，直径为10～15 µm，细胞质均一化(图2B)。脾出现大量铁血黄素沉积(图2C)。健康鱼的头肾呈致密的网状结构(图2D)。病鱼的头肾组织中可见大量嗜碱性的肿大细胞(图2E)，且组织结构松散，大量细胞发生核固缩，红细胞浸润，多见细胞崩解后形成的坏死灶(图2F)。健康鱼肝脏细胞大小、形状均一，结构清晰排列紧密 (图2G)。病鱼肝脏细胞膜崩解，边界模糊，细胞连成一片，造成双核假象；细胞核肿大而核质溶解呈透亮状；肝血窦周围细胞发生淀粉样变性，胞质呈现云雾状的嗜酸性染色(图2H)。病鱼肝脏内可见局灶性坏死，并零星出现嗜碱性的肿大细胞(图2I)。健康鱼的肾组织结构饱满、清晰(图2J)。病鱼的肾造血组织坏死、细胞核固缩；出现嗜碱性的肿大细胞，但数量比脾和头肾组织中少。病鱼肾小管上皮细胞肿胀，细胞核空泡化(图2K)。肾小球血管球细胞水样变性，肾小囊腔变窄(图2L)。健康鱼鳃上皮细胞单层有序排列，次级鳃丝结构清晰(图2M)。病鱼鳃组织结构松散，次级鳃丝肿胀(图2N)，且上皮细胞剥离、脱落；部分柱细胞断裂，导致毛细血管扩张症(图2O)。健康鱼心肌细胞结构清晰规整(图2P)。病鱼心肌纤维结构松散、紊乱，心肌退化变性，胞质液化呈均质玻璃样物质。严重者心肌细胞坏死，细胞崩解留下带状坏死灶(图2Q)。病鱼肠组织病变不明显；肠黏膜固有层零星出现细胞质均一、嗜碱性的肿大细胞，细胞核固缩于细胞边缘，或异常肿大，核质溶解呈透亮状(图2R、图2S)。病鱼胃黏膜下层退化变性，细胞出现坏死崩解，留下不规则的坏死灶(图2U)。

2.3 超微病理观察

透射电镜观察发现，病鱼脾造血组织细胞核异染色质增多，核膜可见但不清晰，核周隙明显扩张，严重者细胞核碎裂。细胞质中内质网囊泡化，线粒体肿胀、嵴消失(图3A)。肿大细胞胞质中存在大量虹彩病毒样病毒粒子，无囊膜，直径为 130～150 nm (图3B)。病鱼头肾造血组织中发现含有大量病毒颗粒的肿大细胞，且线粒体肿胀、嵴消失，细胞质中囊泡增多；特别是肿大细胞的细胞膜内陷形成大量树枝状沟回结构(图3C)。出现核固缩的凋亡小体(图3D)。病鱼肝细胞膜出现破损或结构异常，核内大部分染色质溶解，核外形可见，粗面内质网囊泡化形成的小泡脱粒、破裂，线粒体破损；严重者细胞核消失，出现嗜锇性髓鞘样小体，胞内模糊不清，结构基本消失(图3E、图3F)。病鱼肾小管上皮细胞核固缩或出现核沟，细胞内出现初级溶酶体，线粒体嵴肿胀呈管泡状，刷状缘发生断裂(图3G)。肾造血组织肿大细胞的细胞膜内陷，核形状异常，核仁增大(图3H)。病鱼次级鳃丝上皮细胞、柱状细胞病变严重。线粒体嵴肿胀、空泡化，基质电子密度增大；出现S或Y形的畸形线粒体，以及大量纵向嵴线粒体；细胞核周间隙扩张，粗面内质网囊泡化并脱粒(图3I、图3J)。病鱼鳃血管及白细胞中观察到大量的病毒粒子(图3K、图3L)，表明病毒可经由血液循环感染鱼体各个组织。病鱼心肌细胞出现灶性溶解损伤，可见大量初级溶酶体(图3M)。血管及白细胞中可见零星的病毒粒子(图3N、图3O)。心肌细胞的线粒体损伤，出现大量髓样体(图3P)。还可见许多纵向嵴、嵴溶解和形状畸形的线粒体(图3Q)。

2.4 寄生虫检查和细菌分离

所检患病褐龙斑均未观察到寄生虫。病鱼的肝、肾、脾接种的TSA和TCBS培养基上仅长出零星的菌落，非细菌性疾病特征。经16S rDNA测序鉴定，分别为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、弧菌(Vibriospp.)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)、交替单胞菌(Alteromonassp.)、亚硫酸盐杆菌(Sulfitobactersp.)等。

2.5 病鱼组织的PCR检测

3尾病鱼的脾、头肾等组织，用引物1-F/1-R和4-F/4-R进行PCR检测，结果均为强阳性，而健康褐龙斑未扩增出任何条带(图4、图5)。依据行业标准SN/T 1675-2014，可初步判定在褐龙斑各组织中发现的病毒为RSIV。

2.6 感染褐龙斑的虹彩病毒分类鉴定

从病鱼脾组织中扩增得到了病毒(命名为LZ170711株)DNA 片段，长度为 1581 bp。经 Blast 比对分析，该序列包含MCP基因完整的编码区及其上游57个、下游162个核苷酸。其中，MCP基因编码区全长为1362 bp，编码453个氨基酸。

与GenBank数据库中18种(株)虹彩病毒的相应序列进行比对发现，LZ170711株与细胞肿大病毒属虹彩病毒各毒株相似性在94%以上；而与蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、绿虹彩病毒属和虹彩病毒属虹彩病毒各毒株的相似性均在 55%以下。在细胞肿大病毒属内，与 RSIV各分离株相似性均超过 97%，与ISKNV和 TRBIV的各分离株相似性为 94.5%～ 95.1%。LZ170711 与 RSIV TGA14、RSIV 10GG、RSIV-8、RSIV-9的MCP基因序列完全一致，与RSIVEhime-1、RSIV 2HSB株有9个核苷酸的差异，相似性为97.9%。

图3 病鱼的超微病理变化(标尺为 1 µm) Fig.3 Ultrastructural changes in the diseased fish (Bar=1 µm)

图4 使用引物1-F/1-R检测患病和健康褐龙斑Fig.4 PCR results of diseased and healthy fish using primer 1-F/1-R

图5 使用引物4-F/4-R检测患病和健康褐龙斑Fig.5 PCR results of diseased and healthy fish using primer 4-F/4-R

依据上述结果，用Mega 7软件构建了包含19种(株)虹彩病毒的系统发育树(图6)。从图6可以明显看出，这些虹彩病毒分为5个病毒属，LZ170711株位于细胞肿大病毒属内，且与RSIV各分离株的关系最近。

3 讨论

鱼类感染了肿大细胞虹彩病毒后，通常会体色变暗、游动异常、反应迟钝、嗜睡，且出现脾、肾组织肿大等症状(王庆等,2010; 何建国等,1998)。本研究发现，患病褐龙斑反应迟钝，脾、肾肿大，且脾质地易碎。类似的病症在患病尖吻鲈(Lates calcarifer)和褐篮子鱼(Siganus fuscescens)中也有报道(文琳等,2015; 雷燕等,2014)。这些症状可用于肿大细胞虹彩病毒病的预警和初步诊断。

在组织病理方面，观察到病鱼各组织中存在细胞变性、凋亡等由病毒感染引起的典型病变。病鱼脾和头肾是肿大细胞虹彩病毒的靶器官，病理切片中可见大量嗜碱性、匀质化、直径为15～20 µm的肿大细胞，是该病的重要病理特征(Jancovichet al,2012)。通过超薄切片的电镜观察，在脾脏、头肾的肿大细胞中发现大量装配完成尚未释放的病毒粒子。令人感兴趣的是，在电镜超薄切片中，经常可以观察到肿大细胞的细胞膜具有大量的树枝状沟回结构，其形成原因和生理学意义尚不清楚，值得进一步研究。此外，在病鱼心脏和鳃的血管、白细胞内也发现了一定数量的病毒粒子，表明肿大细胞虹彩病毒可以通过血液循环在鱼体各器官和组织内扩散(秦蕾等,2009)。尤其值得指出的是，一方面，本研究发现患病褐龙斑出现明显的心肌萎缩、断裂、间隙变大等病理特征，与此前报道的感染了虹彩病毒的条石鲷(Oplegnathus fasciatus)心脏病理特征一致(李华等,2011)。另一方面，在超薄切片中观察到，病鱼心肌细胞的线粒体病变明显。大量的心肌细胞线粒体或出现纵向嵴，或退化成同心圆状的髓样体，意味着其呼吸功能的严重丧失。综合上述病理特征，病鱼心脏出现了严重的病理损伤，影响了鱼体的血液循环，造成供氧不足，由此导致病鱼表现出游泳无力、反应迟钝、嗜睡等表观症状。

图6 依据MCP基因构建的19种(株)虹彩病毒系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of 19 iridovirus isolates (strains) based on the complete coding sequence of MCP gene

MCP是虹彩病毒最主要的结构蛋白，其基因既高度保守，又有足够的变异性，可以充分反映虹彩病毒的演化关系，是虹彩病毒分类鉴定的重要依据(Inouyeet al,1992; Chouet al,1998)。本研究测定并分析了感染褐龙斑的虹彩病毒的MCP基因，构建了虹彩病毒系统发育树，证实该病毒在分类地位上属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属真鲷虹彩病毒类群。感染褐龙斑的该病毒与感染真鲷(Pagrus major)的RSIV-8、感染高体(Seriola dumerili)的 RSIV-9、感染斜带石斑鱼(E.coioides)的 RSIV 10GG、感染褐点石斑鱼 (E.fuscoguttatus)的RSIV TGA14，其MCP基因编码区全序列完全一致，可以认为它们是同一种病毒。这表明RSIV的敏感宿主范围很广，其对多种海水鱼类均具有极强的致病性。RSIV对褐龙斑的致病性此前未见有报道，有待深入研究。