模拟舰船冲击运动对坐姿状态下兔腰椎间盘损伤效应的研究

陈佳海，阮狄克，胡 明，徐 成，刘立洋，王 静，巨圆圆，李 军

水面舰艇是现代海战中至关重要的作战力量之一，在海战中，当水面舰艇受到水下炸弹(水雷、鱼雷、深水炸弹)的攻击时，这种非接触性的爆炸可引起舰艇的强烈冲击，尤其以垂直向上的冲击运动最为剧烈，即舰船冲击运动，这样的冲击作用可造成舰艇仪器设备的损害及舰员的损伤[1]，甚至危及生命，严重影响舰艇战斗力。坐姿是舰员在舰艇上的一种常见姿势，Zong和Lam[2]通过建立集中参数系统模拟研究垂向冲击时对坐姿人体的生物动力响应；黄建松等[3]建立椎间盘的应力松弛和蠕变实验，这些研究主要采用力学推导，关于舰艇冲击运动对坐姿状态下动物的实验研究及损伤效应的研究尚未见相关报道。我们前期研究已经证明脊柱损伤是坐姿状态下的常见伤情之一[4]，为进一步研究兔在舰船冲击后损伤效应的变化规律，本实验研究舰船冲击运动对坐姿状态下兔腰椎间盘损伤及腰椎间盘退变的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性新西兰兔20只，4月龄，体质量2.5～3.0 kg，由中国人民解放军总医院第六医学中心动物实验中心提供，编号：[SCXK-(京)2012-0004]，动物实验经中国人民解放军总医院第六医学中心伦理委员会核准[医伦字(2015)085号]。实验动物按随机数表法随机分为3组：对照组(A组，4只)，轻度冲击组(B组，8只)，重度冲击组(C组，8只)。

1.2 冲击方法 采用海军某研究院的冲击机(最高速度5 m/s)，轻度冲击速度约2.5 m/s，重度冲击速度约4.8 m/s，对照组放在冲击机边上。冲击组：先以速眠新Ⅱ 0.08 mL/kg镇静，然后将兔固定在特制的座椅上，尽量模拟人的坐姿状态(图1)。分别以2.5 m/s和4.8 m/s冲击1次，冲击后观察10 min兔的反应后，随后将兔带回动物实验中心观察。

图1 模拟坐姿状态的实验动物

1.3 X线检查 冲击后3 h，以速眠新Ⅱ 0.08 mL/kg镇静兔后于我院放射科行X线检查。

1.4 磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查 冲击后第1周、第4周及第12周时对兔行MRI检查，用速眠新Ⅱ 0.15 mL/kg将兔麻醉后取仰卧位，以腰部为中心，将获得的影像资料由2位盲化的高年资医师阅片并对椎间盘髓核采用Pfirrmann分级标准进行分级[5]，若有分歧时则讨论后决定。分析比较不同组别动物在不同时刻腰椎间盘的Pfirrmann分级。

1.5 大体解剖及组织学检查 所有动物于冲击后第12周时以速眠新Ⅱ 0.15 mL/kg麻醉，采用股动脉放血的方法处死后进行解剖，观察兔腰椎间盘损伤情况。腰椎间盘的处理：根据MRI检查结果先判断出可能损伤的腰椎间盘，用微型锯将兔L5-S1椎间盘连同软骨终板锯下，立即以10%福尔马林固定1周，于Perenyi’s脱钙液中脱钙1周，脱钙后行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和天狼星红染色，在普通光镜下观察腰椎间盘的组织结构，天狼星红染色则通过偏振光镜观察胶原纤维的变化。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0软件，等级资料的比较采用Mann-WhitneyU检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冲击后兔的一般状况 冲击后无即刻死亡的动物，实验动物均出现明显的受惊反应，未见二便失禁及肢体功能障碍，实验过程中B组死亡2只；C组死亡1只。

2.2 X线检查 所有兔均未发生骨折。

2.3 MRI检查 在伤后第1周、第4周和第12周时对兔行腰椎MRI检查，图2为MRI的T2加权像，a为正常对照组腰椎间盘，b为重度冲击组发生退变的腰椎间盘(L7-S1)。对照组、轻度冲击组和重度冲击组兔的腰椎间盘Pfirrmann分级情况见表1，对照组与轻度冲击组、重度冲击组比较，差异比较有统计学意义(P<0.05)；而轻度冲击组和重度冲击组比较，差异比较无统计学意义(P>0.05)。冲击后第1周、第4周及冲击后第12周兔的腰椎间盘Pfirrmann分级情况如表2，冲击后第1周和第4周时差异比较无统计学意义(P>0.05)，冲击后第4周、第12周分别与冲击后第1周时比较，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，冲击造成了坐姿状态下兔的腰椎间盘发生了退变。

a：对照组；b：重度冲击组图2 兔腰椎间盘MRI随时间的变化

检查时间A级B级C级D级E级对照组207100轻度冲击组1029300重度冲击组1529500

注：对照组和轻度冲击组的比较，U=-3.734,P<0.001；对照组和重度冲击组的比较，U=-3.343,P=0.001；轻度和重度冲击组的比较，U=-0.358,P=0.700

表2 不同时刻冲击组动物的L1-S1(共7个)椎间盘Pfirrmann分级情况(个)

注：冲击后第1周与第4周比较，U=-1.456，P=0.145；冲击后第1周和第12周比较，U=-4.380，P<0.001；冲击后第4周和第12周比较，U=-3.013，P=0.003

2.4 腰椎间盘的组织学染色检查 典型的L7-S1椎间盘正中矢状位剖面见图3，其HE染色见图4，天狼星红染色见图5(a、c为卤素灯光下的明场图像，b、d为偏振光下的图像)。

a：正常腰椎间盘；b：Pfirrmann C级腰椎间盘图3 兔腰椎间盘正中矢状位剖面图

a为正常腰椎间盘HE染色清晰显示上下骨性终板、前后纤维环与中央的髓核；b为a图的局部放大图像，可见纤维环有序排列；c为退变腰椎间盘，可见纤维环与髓核界限不清，髓核的细胞形态发生改变，d为c图的局部放大图像，箭头所示部位为增生的纤维结构，纤维环排列紊乱图4 兔腰椎间盘HE染色

a：正常腰椎间盘天狼星红染色在普通光镜下的图像；b：可见折光性强的Ⅰ型胶原纤维排列较多且紧密；c：退变腰椎间盘天狼星红染色在普通光镜下的图像；d：可见折光性弱的Ⅱ型胶原较多且结构疏松，折光性强的Ⅰ型胶原相对减少，髓核组织区域中出现红、黄色的Ⅰ型胶原图5 兔腰椎间盘天狼星红染色

3 讨论

水下爆炸可引起舰船剧烈的上下起伏运动，尤其以垂直方向为主，不同强度的水下爆炸可对舰员造成不同程度的损伤[3，6]。柯文琪、刘新祥等[7-9]结合舰船冲击伤动物实验及模拟人实验，建立了数学模型，制定GJB 2689-96《水面舰艇冲击对人体作用安全限值》标准，初步奠定了舰船冲击伤方面的研究基础，然而其实验均以动物的自然体位进行研究。刘新祥[10]建立了坐姿的非线性人体模型，计算坐姿人体受到的冲击力量。通过该模型计算，在4.572 m/s的冲击作用下脊柱受到的压缩载荷是7.2 kN，该模型采用的验算数据基于美国David Taylor船池的真人冲击试验结果[11]，具体实验数据无法获得，缺乏损伤后中远期变化相关研究。黄建松等[3]通过数学模型和尸体研究对胸、腰椎模型进行蠕变试验和应力松弛试验，研究主要基于力学推导和尸体研究，对坐姿状态下伤情未能获得相应的具体伤情和病理改变。既往动物实验主要以自然体位为主[12]，而人体主要姿势为站姿、坐姿和卧姿，坐姿也是海战时常见的姿势，前期的研究表明舰船冲击运动容易损伤坐姿状态下兔的脊柱和睾丸，因此腰椎间盘的损伤及其损伤后效应是本实验研究的主要内容。

椎间盘的损伤可导致退变，然而这是一个复杂的、多因素导致的病理生理过程[13-15]。Lipson和Muir[16]用手术刀对兔椎间盘造成损伤，在损伤后1周即出现纤维环与髓核分界模糊，4周后髓核开始出现纤维化，12周时髓核更加干燥和纤维化，6个月时出现了“蟹肉”样组织，观察到椎间盘大体结构上发生形态学的退变。Cinotti等[17]证明软骨终板的损伤也可导致椎间盘的退变。本实验研究模拟舰船冲击运动对坐姿状态下的兔进行冲击并连续观察12周，至12周时，冲击组的兔腰椎间盘可出现明显的退变，可见正常的髓核组织为纤维组织所替代，结构紊乱；HE染色中已未见正常髓核细胞的形态，纤维环与髓核界限不清，纤维组织增生，纤维环排列紊乱；天狼猩红染色也显示退变椎间盘的胶原纤维的构成发生了改变。退变椎间盘在兔脊柱MRI的T2加权像上表现为信号的减低。任东风等[18]描述了山羊腰椎间盘损伤后不同时间点的MRI表现及组织学改变，人为刺伤的椎间盘MRI改变在3周时与伤前差异无统计学意义，而3个月和6个月时差异有统计学意义，与本研究结果基本类似。赵新刚等[19]用24G针头刺伤兔椎间盘3次，可在4周时发现兔椎间盘退变。本研究中，重度冲击较轻度冲击对兔椎间盘的Pfirrmann分级有一定的影响，然而差异比较无统计学意义，这可能与损伤程度差异不够或者观察的时间不够有关。在本次试验中发现Pfirrmann C级的椎间盘集中分布在L6-L7、L7-S1，L6-L7是兔腰椎曲度最大的节段，而L7-S1处于腰椎和骶椎之间，同时这两个节段是所有椎间盘中最靠下的两个节段，受到的冲击力量也最强，因此退变程度也最严重。

经过12周的观察，本研究证实了舰艇冲击运动可造成坐姿兔腰椎间盘的退变。同时本研究也存在一定的局限性：①实验动物需要镇静，无法较好模拟坐姿的情况；②模拟舰艇冲击运动仅冲击动物1次，出现明显退变的时间晚，退变程度不够重；③由于时间所限，对动物观察的时间也比较短，无法观察到更严重的退变情况。