染色体双荧光显带鉴定啤酒花雌雄株及其在生物学实验教学中的应用

陈春丽, 冯燕妮, 黄 涛

(华中农业大学 生命科学技术学院， 武汉 430070)

染色体显带技术(chromosome banding technique)是一项通过显带染色等处理分辨出染色体更微细的特征，如带的位置、宽度和深浅等的技术。常见染色方法有喹吖因荧光染色技术、Giemsa染色技术等[1]。这些方法显示的物种及染色体特异性荧光带型，可以用来有效鉴别染色体和研究染色体的结构与功能[2-3]。随着荧光染料的发现，荧光显带技术在染色体核型分析、性别鉴定等应用中日渐广泛。常见核酸荧光染料主要有色霉素(chromomycin A3，CMA )、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI )、碘化丙啶(PI)及Hochest33258等。其中CMA为GC特异型荧光染料，DAPI为AT特异型荧光染料。Yamamoto等利用CMA与DAPI双荧光染色法分析柑橘类植物的染色体带型，有效鉴定了不同柑橘品种[4]。张扬等利用45S rDNA-FISH鉴定银杏雌雄性别，表明银杏性别决定与随体染色体数有关[5]。

自然界中约4%被子植物是雌雄异株植物[6]，如常见的木本植物杨树、柳树、银杏、柿等，草本植物菠菜、大麻、栝楼等。这些雌雄异株植物为研究植物的性别决定和进化提供了很好的实验材料[7-8]。研究雌雄异株植物的染色体特征及性别决定，有利于进一步揭示性染色体起源和进化机制，同时对哺乳动物性别进化研究也具有重要参考意义[9-10]。由于不同性别的同种植株在生理形态、生物学特性和经济价值等方面存在一定差距，所以在实际生产中，如林业生产、园艺事业以及果蔬种植，常常会根据经营目的从中选择栽培某一种性别的植物，以获得较好的经济效益[11-12]。少数植物可以从植株的枝、叶、花等外部形态观察识别雌雄株，或从同工酶、指示生理指标和新陈代谢的酸性和碱性磷酸酶活力等差异来鉴别雌雄株[13-15]，以及根据雌雄株代谢产物的不同用溴麝香草酚蓝化学染色进行性别鉴别等[16]。但是多数雌雄异株植物幼龄期的外部形态没有明显的区别，其同工酶、磷酸酶活力和代谢产物差异也不显著[17-18]，故早期区分雌雄株存在较大困难。因此，不论在理论价值上还是实践意义中，对雌雄异株植物开展早期性别鉴定都非常重要。

啤酒花，学名HumuluslupulusL.，别名蛇麻草，葎草属植物，雌雄异株，雌花穗状，雄花圆锥花序。在啤酒酿造中所用均为雌花。因此，在生产中一般栽培经济效益大的雌性啤酒花。染色体双荧光染色法用于啤酒花苗期性别鉴定，简单、快速，对指导啤酒花生产、啤酒花经济产链的发展具有较好意义。啤酒花基因组大小为25.7 亿碱基，染色体数目2n=20[19]，比较容易观察。这些生物学特性使啤酒花成为染色体双荧光显带鉴定植株性别的代表植物。将这一染色体荧光显带代表植物用于高校生物学实验课程教学，可以使学生拓宽视野、开阔思路，培养学生综合应用各科所学知识的能力，在实验中激发和培养学生的创新和创造能力，也可以为高校生物学实验课程改革提供新的实验素材。

染色体荧光显带技术是认识染色体结构的重要方法，是在常规染色体计数方法基础之上的提升，用于高校生物学实验课程具有明显优势及很好可行性。其实验操作步骤相对比较简单，染色体计数是常规实验，本实验设计仅需在染色体计数实验基础上增加一步荧光染色即可。完成该实验流程的周期短，只需6～8周。具体从取材到观察实验结果仅需8学时。得到实验结果相对不难，但要得到高质量的实验数据就需要学生有工匠般的实验精神。在生物学实验教学中增加此项内容，一方面可以推动实验课程的更新，为植物生物学、植物显微技术、遗传学及细胞工程等课程的实验教学改革提供新思路；另一方面，有助于培养学生的实践动手能力和综合实验能力，使学生体会到植物生物学知识和染色体荧光显带技术的趣味性、实用性与先进性。

1 实验原理

染色体的结构组成特点：细胞分裂时期，染色体浓缩，形成端粒、着丝粒，NOR(核仁组织区)等光镜下可见的形态结构。按染色体状态，可分为常染色质和异染色质。

荧光染料的特性：不同荧光染料可以分别结合在染色体不同结构区域，具有碱基特异性。常见核酸荧光染料主要有色霉素(CMA)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI )、碘化丙啶(PI)等。其中CMA为GC碱基特异型荧光染料，在450 nm激发光下发出570 nm的黄色荧光；DAPI为AT碱基特异型荧光染料，在358 nm激发光下发出461 nm的蓝色荧光。

2 教学设计与安排

2.1 教学目的

本实验的教学目的主要包括3点内容：1)观察啤酒花植物染色体形态结构；2)掌握植物染色体制片技术；3)掌握染色体荧光显带技术。

2.2 教学重点与难点

本实验的教学重点和难点包括：1)教学重点，植物染色体的形态结构；2)教学难点，染色体制片。

2.3 实验材料与设备

1)实验材料：啤酒花植株根尖。2)实验仪器及工具：体视显微镜、相差显微镜、带数码摄影系统的荧光显微镜、镊子、解剖针、刀片。3)实验试剂：果胶酶、纤维素酶、乙醇、冰乙酸、饱和对二氯苯、氯化钾、色霉素(CMA)、DAPI。4)实验耗材：载玻片、盖玻片、滤纸、试剂瓶等。

2.4 教学安排

2.4.1 学时安排

本实验共分为3个阶段：1)啤酒花根尖材料准备；2)染色体制备；3)染色体荧光染色、观察与记录；4)实验结果分析与讨论。课上8学时，课前准备2学时，课后实验结果分析讨论2学时。

2.4.2 课前准备

啤酒花地下茎扦插或绿枝扦插生根(提前6～8周扦插繁殖)，实验相关药品配制等。

2.4.3 学生分组

建议实验中每5人为1组。组员之间协调配合，共同合作完成实验流程，共同分析实验结果，整理实验数据并积极参与讨论。

3 实验步骤

提前6～8周做好啤酒花植株繁殖准备。地下茎扦插法：取生长健壮、长12 cm左右、茎粗1.8 cm、两端切口光滑的啤酒花地下茎作为种苗直接定植。绿枝扦插法：生长健壮的枝蔓截剪，经过消毒和生长调节剂处理后，直接插入苗床。

3.1 啤酒花植株根尖准备

第1天上午，用刀片截取旺盛生长的根尖 (1.5 mm)，置于含冰水混合物的2 mL小离心管中，4℃冰箱过夜。

固定：第2天上午，吸出小管中蒸馏水，0.075 mol/L KCl前低渗30 min(室温)，换入新鲜配制的卡诺固定液(酒精∶冰乙酸=3∶1)固定。

3.2 染色体制备

将固定后的根尖充分水洗后，置于2%纤维素酶+2%果胶酶2∶1混合酶液中，28℃下酶解约3 h。加入蒸馏水，吸出酶液，0.075 mol/L KCl后低渗处理10 min。

吸取1个根尖于干净预冷的载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴2～3滴固定液使材料分散，火烤至着火。

10倍相差物镜显微镜下镜检染色体制片，找出符合要求(每张至少10个染色体分散良好且背景干净的分裂相)的制片备用。

3.3 荧光染色、照相及图像分析

染色体制片双荧光染料染色： 每片加含0.5 mg/mL CMA和5 μg/mL DAPI的抗荧光淬灭剂25～50 μL，盖上盖片(避光)。

荧光显微镜下观察信号，450 nm激发下观察CMA黄色荧光，紫外激发观察DAPI蓝色荧光。数码显微摄影系统照相。Photoshop软件编辑处理图像。

4 实验结果

4.1 啤酒花染色体的CMA、DAPI荧光带型

啤酒花雌株和雄株都分别具有20条染色体(2n=2x=20)，见图1，其中二倍体雌性啤酒花的核型公式是：14 m+4 sm+2 Xm (图1-A、图2)；二倍体雄性啤酒花的核型公式是：14 m + 4 sm + Xm + Ym(图1-B、图3)。啤酒花每条染色体的着丝粒非常清晰，容易判别，且好的染色体制片还可以清楚观察到每条染色体的两条姐妹染色单体(图1-A)，以及尺寸最小的雄性Y染色体(图1-B，白色箭头所指)。

分别通过CMA、DAPI两种荧光染料对啤酒花雌雄株染色体进行荧光染色观察，结果发现，CMA荧光和DAPI荧光都显示出了啤酒花染色体的整体特征，染色体上没有明显的CMA带型特征呈现。但我们仔细观察并统计，发现CMA荧光染色能非常清楚地显示出染色体上的随体结构(图2和3)。图2-A、C所示在雄株染色体上有2个明显的点状随体，且与染色体主体呈分离状。图2-B、A、D、C分别为啤酒花雄株同一个细胞分裂相，为DAPI荧光染色图像，与CMA荧光染色图像相比较，2个点状随体的荧光显色不明显，在观察中容易被忽视。通过CMA、DAPI双重荧光染色，观察到啤酒花雌株染色体具有1个点状随体(如图3-A、B中有尾箭头所指部位)和1个不明显的浓缩随体(图3-A、B中无尾箭头所指部位)。

A 雌株，2n=2x=20； B 雄株，2n=2x=20，白色箭头所指为Y染色体；标尺=20 μm

图1 啤酒花雌雄株中期染色体(DAPI染色)

Figure 1 Metaphase chromosomes inH.lupulusby DAPI staining

4.2 啤酒花随体染色体与性染色体

通过染色体的形态特征可知，染色体上主缢痕区域为着丝粒，次缢痕区为随体，即核仁组织区(Nucleolar organizing region，NOR)。啤酒花染色体的形态图结果显示，雄株有2条染色体上分别具有2个明显呈伸展状态的随体(如图2-A、C中有尾箭头所指部位)，雌株1条染色体上具有1个明显呈伸展状态的随体(如图3-A、B中有尾箭头所指部位)，另1条染色体上具有1个不明显的浓缩状态随体(如图3-A、B中无尾箭头所指部位)。二倍体雌性啤酒花有两条X染色体，而雄性啤酒花只有一条X染色体，还有一条Y染色体。啤酒花雌雄株中染色体的形态结构差异不仅仅表现在一对性染色体的大小差别，同时在染色体NOR位点及伸展状态上也有体现。虽然，不论是雌性还是雄性啤酒花都有两个NORs，但是通过CMA染色，我们发现雌性啤酒花两个NORs，只有一个位点有活性，呈伸展状态，另一位点沉默，呈浓缩状态。然而在雄性啤酒花中，两个NORs都有活性，都呈伸展状态。

综合以上结果，我们分别绘制了啤酒花雌雄株染色体模型，如图4和图5所示。啤酒花雌雄株都含有10对染色体。雄株中第6对染色体具有一对呈伸展状态、有活性的NORs，并含有一条X染色体和具有最小尺寸的Y染色体(图4)。雌株中第5对染色体具有一个呈伸展状态、有活性的NOR和一个呈浓缩状态、沉默的NOR，并含有2条X染色体。

A、C为雄株染色体CMA染色，箭头示意CMA显带的2个随体；B、D为A与C图中染色体DAPI染色。标尺=20 μm

图2 啤酒花雄株CMA-DAPI显带中期染色体

Figure 2 Metaphase chromosomes in maleH.Lupulusby CMA-DAPI staining

A：雌株CMA/DAPI显带中期染色体，箭头示意CMA显带的信号，其中有尾箭头示意CMA显带的一个随体，无尾箭头示意另一同源染色体端部CMA信号；B：雌株CMA/DAPI显带早中期染色体，箭头示意CMA显带的信号，其中有尾箭头示意CMA显带的一个随体，无尾箭头示意另一同源染色体端部CMA信号；标尺=20 μm

图3 啤酒花雌株CMA/DAPI显带染色体

Figure 3 Metaphase chromosomes in femaleH.Lupulusby CMA-DAPI staining

5 讨论与结论

5.1 开设该实验项目的意义

自然界中许多雌雄异株植物的雌株与雄株染色体组成具有显著差异[6, 9]。该实验课程将染色体制片与荧光显微镜技术相结合，可以在有限的课时安排中使学生获得较好的实验结果，使同学们直观地观察到啤酒花雌雄株染色体形态结构的差异特征。该实验项目的开展不仅让学生了解研究细胞遗传学的方法，同时也让学生对染色体荧光显带技术有一定的认识。通过该实验课程的学习，学生应该能够独立完成所需材料的准备、试剂的配制、染色体制片方法和双荧光染色技术，熟练掌握荧光显微镜的使用方法，拍摄到质量较好的染色体荧光照片，并能规范地展示实验结果。

图4 啤酒花雄株染色体模型

图5 啤酒花雌株染色体模型

5.2 实验安排的可行性

该实验课课时安排为8学时。该实验项目包括植物染色体制片技术、染色体双荧光染色技术与荧光显微镜观察等细胞生物学的基本技术手段，这些技术所涉及的相关实验在部分高校已有开展，并且也具备一定的实验条件。

5.3 本实验的推广与应用

1)实验条件：要求具备植物培养室和荧光显微镜基本条件。2)教师的要求：实验教师应熟练掌握扦插繁殖、双荧光染色的基本操作方法，熟练掌握荧光显微镜的基本构造和使用方法。3)可在已开设植物染色体计数相关实验的院校推广。4)实验材料：啤酒花，即使由于气候、地域限制，温室等植物种植条件等限制，还可以考虑换用校园常见植物葎草来代替。葎草(HumulusjaponicusSiebold&Zucc)，又叫拉拉藤，雌雄异株，分布广泛。葎草与啤酒花同属葎草属植物，其染色体与啤酒花的染色体大小相似，数目相近，且同为雌雄异株植物。葎草雌株染色体16条，2n=16=14+XX；雄株染色体17条，2n=17=14+XY1Y2[20-21]。因此，本教学设计也可以因地制宜，采用分布广泛的葎草来作为实验材料。

本文通过设计生物学实验教学中使用的雌雄异株植物材料，结合染色体的双荧光染色, 获得直观、特异和清晰的图像，使学生能够更好地掌握双荧光染色技术以及理解染色体的形态结构特点。该实验课程设计简单可行，适合在高校生物学实验教学中推广，是将科研成果应用于教学实践的具体实例，为进一步加强科研成果促进教学改革提供了思路和借鉴，同时也为研究雌雄异株植物的苗期性别鉴定提供了技术参考。