hAOX 在人肾癌组织中的表达及其与临床生物学行为的关系

高万峰，于新路，李 青，张珊珊，宋 博，王 雪，苏 宏

肾癌是泌尿系统第二位的恶性肿瘤，其发生发展的分子机制一直是研究的重点和难点。探寻更多参与肾癌发展的相关机制，进而挖掘有效治疗方法是提高肾癌远期疗效的重要手段。人醛氧化酶(human aldehyde oxidase, hAOX)是钼-黄素酶家族(molybdo-flavoenzyme family, MFF)中的一类蛋白，在肝、肺、小肠等组织中均有表达[1-3]，其活性水平己成为评价临床用药及治疗效果的一项重要参数。近几年来，越来越多的证据表明，hAOX与许多临床疾病的病理生理学变化有关[4-5]。尽管hAOX的生理生化功能研究较多，但其在生理机制及发生作用等方面的信息还比较匮乏，国内关于hAOX在人肾肿瘤组织中的表达及意义还未见报道。本研究应用免疫组织化学法和Western印迹法检测肾癌及癌旁肾组织中hAOX的表达，探讨其与肾癌临床生物学行为的关系及预后的重要意义。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2004-01至2012-12手术切除的肾癌标本86例，其中武警辽宁总队医院28例，沈阳军区总医院58例。男51例，女35例，年龄36～88岁，中位年龄62岁。所有病例均为初次手术，术前均未行介入、放化疗等治疗，所有术后标本均由高年资病理医师参照第九版Arkman外科病理学[6]标准作出诊断，均证实为肾癌。其中透明细胞癌64例，乳头状肾细胞癌18例，颗粒细胞癌4例；参照2002年AJCC肾癌 TNM分期标准界定[7]，Ⅰ期26例、Ⅱ期31例，Ⅲ+Ⅳ期29例，肿瘤直径≤2.5 cm者47例，>2.5 cm者39例。伴有淋巴结转移31例，无淋巴结转移55例。另取距离癌灶至少5 cm处正常肾组织20例作为对照。

1.2 试剂与方法 免疫组织化学Envision detection system试剂盒(兔/鼠双标)购于上海鼎杰生物技术有限公司，hAOX兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶100。即用型非生物素标本常规脱蜡，Envision法严格按试剂盒说明书操作。每次染色均以肾癌阳性切片作为阳性对照，PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 免疫组化染色结果采用双盲法判定。每张切片均由两位高级职称病理医师独立阅片，两位诊断意见均为阳性方视为阳性。按照着色强度和阳性细胞率计算评分。其中不着色者记0分，淡黄色记1分，棕黄色者记2分，棕褐色记3分；阳性细胞百分率<5% 时记0分，5%～25%时记1分，26%～50%时记2分，51%～75%时记3分，76% ～100%时记4分。着色强度与阳性细胞百分率的得分相乘的积即为最终得分，≥6分者即判定为阳性，<6分者即判定为阴性。

1.4 统计学处理 采用Prism 6.0软件进行数据统计处理，hAOX的表达率与患者各临床因素之间的关系采用χ2检验和Fisher确切概率法，检验水准α=0.05。生存分析采用K-M方法和Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hAOX在肾癌及癌旁组织中的表达 86例肾癌标本中，免疫组化hAOX的阳性表达率为22.09%(19/86)，阳性产物主要分布于胞核和胞浆，均显示为黄色-棕褐色颗粒。癌旁组织中hAOX的阳性表达率达85.0%(17/20)，两者表达率比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 hAOX在肾癌组织中的表达与临床病理特征的关系 免疫组化结果显示，hAOX的表达与肾癌患者的年龄、性别、组织类型及肿瘤直径均无关；但在淋巴结转移、TNM分期及Ki-67表达方面有一定的相关性(分别为χ2=7.014，P=0.010；χ2=3.592,P=0.026；χ2=6.432，P=0.047)。见表1。

2.3 hAOX的表达与肾癌5年生存率的相关性分析 免疫组化结果显示，在hAOX(+)表达的患者中，其5年生存率为51.72%，明显高于hAOX(-)表达的患者组(7.02%)(χ2=5.736，P=0.018)。采用K-M法进行生存分析,结果显示hAOX(+)表达的病例预后明显优于hAOX(-)表达的病例(Log-rank检验，P=0.029)。

表1 hAOX的表达与肾癌临床生物学行为关系分析 (n；%)

3 讨 论

肾癌是全球范围内较为常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升。据统计，我国每年新发肾癌病例数量已达到25万，约30%的患者在诊断时已发生远处转移，严重影响生活质量和生存时间[8]。作为MFF中的一类蛋白，hAOX其分类号为 EC 1.2.3.1，通常是由2个相同亚基形成的同源二聚体构成，每个亚基具有2个[2Fe-2S]氧化还原中心、1个黄素辅因子(FAD)和1个底物结合域[9]。研究表明，醛氧化酶广泛存在于生物体内，参与多种生理代谢。

Delpuech等[10]研究表明，hAOX可以将机体内形成的有毒醛类物质氧化为无毒酸，以缓解醛类物质对机体的毒害作用；可参与细胞内电子传递以及在代谢和繁殖等相关的生理活动中发挥重要作用。值得关注的是hAOX在多种肿瘤组织中的表达具有特异性。Neumeier等[11]发现，脂肪肝和高脂肪饮食会出现hAOX的高表达，脂联素可通过过氧化物酶增殖物激活受体-α(PPAR-α)来下调hAOX的表达，进而避免由酒精及肥胖引起的脂肪肝。Shaw等[12]也证实hAOX产生的活性氧(ROS)与乙醇引起的肝脏毒性关系很大。李红等[13]在蛋白水平检测了肝癌细胞系、原发性肝癌及癌旁组织中的表达情况，发现hAOX 在癌旁组织中的表达明显高于肝癌组织，Western印迹也证明这一结果，说明hAOX参与了肝脏癌变的发生和发展过程。Huang等[14]研究表明，hAOX在肠道肿瘤组织中的表达较正常组织低，且hAOX的表达与5年生存率呈正相关。

本研究首次从蛋白水平检测了正常肾组织及肾癌组织中hAOX的表达。免疫组织化学检测结果表明，86例肾癌标本中，免疫组化hAOX的阳性表达率为22.09%，阳性产物主要分布于胞核和胞浆。在正常组织中hAOX的阳性表达率达85.0%，明显高于肾癌组织中的表达。另外，在肾癌组织hAOX 的表达与临床病理特征的关系研究结果提示，hAOX的表达与肾癌患者的年龄、性别、组织类型及肿瘤直径均无关；但与淋巴结转移、TNM分期及Ki-67表达有明显相关性。在hAOX(+)表达的患者中，其5年生存率明显高于hAox(-)表达的患者组。且hAOX(+)表达的病例预后明显优于hAOX(-)表达的病例。尽管hAOX与肿瘤发生、发展的相关性研究还较少，但基于以上结果，笔者认为hAOX 的表达可能维持了细胞的正常生长和分化表型，在肿瘤的发生及癌变转化的过程中，其表达水平的降低促进了肾癌侵袭、浸润和转移的能力。最近研究发现，hAOX 表达水平降低致肿瘤转移的机制很可能是通过参与维甲酸的合成实现相关基因的调控，由此诱发癌细胞发生上皮细胞间质转化，进而促进肿瘤细胞发生转移[15]。此外，Ki-67是肿瘤细胞增殖程度的有效指标，此研究表明，hAOX与Ki-67有可能通过竞争性调节作用促进肾癌的转化和转归，其详细分子机制尚需要进一步深入探讨。

综上所述，hAOX在肾癌组织中表达状态与肾癌的发生发展密切相关，本研究虽无法对hAOX的低表达在肾癌中的作用机制做出明确定论，但是为肾癌发展过程中hAOX的进一步研究提供了一定依据和方向。