Bag-1和P53蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达与术后效果的关系

吕金锋 裴继花 王晓明

焦作煤业(集团)中央医院 1 普外科 2 耳鼻喉科，河南省焦作市 454150

甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲状腺癌中发生率最高的病理类型，具有组织分化程度好、恶性程度低的特点；但仍有30%～50%高分化PTC患者早期可发生颈部淋巴结转移或术后复发[1]。恶性肿瘤的发生、增殖和转移特性往往与凋亡机制障碍有关。Bag-1(Bcl-2-associated athanogene 1)是新近发现与膀胱癌、胃癌、白血病等多种恶性肿瘤的发生密切相关的基因，作为一种重要的肿瘤凋亡抑制基因，其表达上调可能参与肿瘤细胞的恶性增殖[2-3]。但也有研究认为[4]，其表达增加可预测较好的临床结局。此外，P53作为一种重要的抑癌基因，其表达失活或突变可诱导肿瘤的发生[5]。基于此，该研究旨在分析Bag-1和P53相关表达蛋白在PTC中的表达与术后效果的关系。

1 对象与方法

1.1 对象资料 选择2014年1月—2016年10月我院诊断的PTC患者96例，手术切除肿瘤组织和癌旁正常组织。纳入标准：(1)年龄18～70岁；(2)病理证实为PTC，未行手术、放化疗及内分泌等治疗；(3)能获得完整病灶组织；(4)患者知情同意。排除标准：(1)妊娠、哺乳期妇女；(2)其他部位原发恶性肿瘤，严重基础疾病；(3)同时参与其他研究，失随访等。其中男30例，女66例，年龄38～66岁，平均年龄(48.7±9.2)岁，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期63例，Ⅲ～Ⅳ期33例，肿瘤最大径1.5～4.8cm，平均最大径(2.9±1.2)cm，颈部淋巴结转移20例。

1.2 研究方法 采用免疫组织化学染色法比较Bag-1和P53蛋白的阳性表达率；采用Western blot法检测Bag-1和P53蛋白定量水平；分析Bag-1和P53蛋白表达与肿瘤临床特征的关系。采用根治性肿瘤切除和淋巴结清扫治疗，随访时间10.0～45.0个月，中位时间30.0个月，比较Bag-1和P53蛋白阳性与阴性表达患者的无疾病进展时间(PFS)、复发率和总生存率。

1.2.1 免疫组化法：常规制作组织切片，厚度5μm，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，抗原修复，加入3% H2O2溶液27℃孵育 20min，滴加正常山羊血清工作液，27℃孵育30min；滴加鼠抗人Bag-1和P53单克隆抗体一抗(江苏碧云天科技有限公司，工作浓度1∶2 000)，置于湿盒内 4℃孵育过夜，以正常小鼠 IgG 代替一抗作为阴性对照；滴加兔抗鼠IgG多克隆抗体二抗(江苏碧云天科技有限公司，工作浓度1∶500)，置于湿盒中27℃孵育20min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(江苏碧云天科技有限公司)，置于湿盒中27℃孵育20min，PBS振荡洗涤5min×3次；DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、氨水返蓝、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、室温晾干、光学显微镜下观察。结果判定：采用半定量法，依据染色强度和染色细胞所占比率；以胞浆或胞核黄染至深棕色为阳性，染色强度中无阳性染色为0分，弱染色为1 分，中等强度染色为2分，强染色为3分；阳性细胞数比率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；两项乘积0～3分为阴性，4～12分为阳性。

1.2.2 Western blot法：组织匀浆后加RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法进行粗定量，每次检测蛋白前使用β-actin抗体对各样本的蛋白量进行剂量标准化检测。取30μg总蛋白，8%SDS-PAGE电泳分离，将分离区带电转移至PVDF膜，加鼠抗VEGF和p38-MAPK单克隆抗体(1∶2 000，美国sigma 公司)静置过夜，加兔抗鼠多克隆抗体二抗(1∶500，美国sigma 公司)室温孵育4h，PBS洗涤，ECL显色。结果扫描保存，Lab Works4.5凝胶成像软件(美国Invitrogen 公司)行半定量分析，以积分光密度(IOD)表示。

2 结果

2.1 Bag-1和P53蛋白阳性表达率的比较 癌组织Bag-1和P53蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 Bag-1和P53蛋白阳性表达率的比较[n(%)]

2.2 Bag-1和P53蛋白定量水平的比较 癌组织Bag-1和P53蛋白相对表达水平也明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 Bag-1和P53蛋白定量水平的比较

2.3 Bag-1和P53蛋白表达与肿瘤临床特征的关系 女性、肿瘤最大径和TNM分期增加以及颈部淋巴结转移者中Bag-1和P53蛋白的阳性表达率增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 Bag-1和P53蛋白表达与肿瘤临床特征的关系[n(%)]

2.4 Bag-1和P53蛋白阳性表达与生存预后的关系 Bag-1和P53蛋白阳性表达者的PFS明显缩短，复发率增加，差异有统计学意义(P<0.05)，总生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 Bag-1和P53蛋白阳性表达与生存预后的关系

3 讨论

李振想等[6]研究指出，Bag-1蛋白在PTC组织中过表达可能与肿瘤发生和发展有关。Bag-1蛋白在正常甲状腺组织中几乎不表达，作为一种多功能结合蛋白，可与酪氨酸激酶生长因子受体、血小板衍生生长因子等结合，发挥抑制凋亡作用；还可与Hsp70、孕激素受体等多种信号因子相结合，调控多条细胞信号转导通路，在肿瘤发生和发展中扮演重要角色[7-8]。Bag-1与Bcl-2形成复合物后抗细胞凋亡能力增强，还可上调 Bcl-2的抗凋亡能力[9]。朱斌[10]研究证实，P53 蛋白阳性表达与PTC的病理分级相关，过度表达可能预示较差的临床预后。Bcl-2和P53均是真核生物体内发挥细胞凋亡的重要分子。

通过该研究得出：癌组织Bag-1和P53蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织Bag-1和P53蛋白相对表达水平也明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。提示Bag-1和P53蛋白表达与PTC的发生有关。Bag-1基因位于9p12号染色体，主要发挥抑制细胞凋亡的功能，具有4种亚型。通过设计针对Bag-1的阻断性抗体免疫治疗或反义核酸基因，或者是基因转染和特异性小干扰RNA技术构建基因沉默体系，封闭Bag-1基因的表达，可加速肿瘤细胞的凋亡进程，为肿瘤的靶向治疗提供重要思路[11-12]。女性、肿瘤最大径和TNM分期增加，以及颈部淋巴结转移者中Bag-1和P53蛋白的阳性表达率增加，差异有统计学意义(P<0.05)。提示Bag-1和P53蛋白表达参与PTC细胞的增殖和转移等行为。PTC的发生与雌激素的分泌及受体功能密切相关，也可能是Bag-1和P53蛋白表达增加的重要机制[13]。进一步随访发现，Bag-1和P53蛋白阳性表达者的PFS明显缩短，复发率增加，差异有统计学意义(P<0.05)，总生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示Bag-1和P53蛋白表达可预测肿瘤的临床结局[14]。

综上所述，Bag-1和P53蛋白在PTC中表达上调与肿瘤临床特征和术后生存结局密切相关，Bag-1和P53蛋白可能成为早期诊断、评估治疗和生存预后的重要分子标志物。研究不足是样本量较小，随访时间较短，因此，结果还需要进一步研究验证。