复方中药脑心通提高THP-1细胞活力的作用研究

邓子亮 陈琼香 郭洪胜 郑采婷 李婉怡 周雅贤 梁艳君 王森 王焱2，（通讯作者）

（1 广东医科大学基础医学院 广东 东莞 523808）

（2 广东医科大学第二临床医学院 广东 东莞 523808）

（3 东莞常安医院心血管内科 广东 东莞 523000）

在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生中，炎症反应及单核/巨噬细胞分泌的大量炎症因子发挥重要作用[1]。巨噬细胞吞噬胆固醇后，转化为泡沫细胞，导致溶酶体破坏，并释放炎症因子，进一步诱导炎症细胞浸润和活化，加剧AS的发生。中药制剂脑心通（naoxintong，NXT）广泛应用于心、脑血管疾病和缺血性疾病，具有抗凝、抗炎、抗氧化、保护内皮、改善微循环、稳定斑块等作用[2]，还可增强机体细胞免疫力及清除自由基[3]，在AS的防治中具有较好的应用前景。人急性单核细胞白血病THP-1细胞在白血病、AS等疾病研究中均有应用，本课题组就NXT对THP-1细胞活力的影响及其作用特点展开实验研究，为进一步研究脑心通防治AS，开发传统中药NXT的新用途提供实验基础。

1.资料与方法

1.1 材料与仪器

THP-1细胞由广东医科大学生化教研室张志珍教授赠送；RPMI1640培养基（美国Gibco 公司，11875）、胎牛血清（美国Gibco公司，10270）；脑心通（陕西步长制药有限公司）； CCK8（日本同仁化学研究所，LH646）；DMSO（D8370），离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TGL-16 L400）、Thermofisher 160i二氧化碳培养箱、BIO-RAD iMark酶标仪、宁波舜宇XD30倒置荧光显微镜、超净工作台、广州诺尔路生物科技有限公司MX-RD-E混匀器。

1.2 方法

1.2.1 THP-1细胞的培养 THP-1细胞培养于37℃、5% CO2培养箱中培养，培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640。每 2～3d传代1次，选用对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 脑心通药物稀释液的制备 将脑心通胶囊中的粉末称重，按照0.1g/ml的质量体积比加入DMSO或无水乙醇（EtOH），室温下于混匀器摇动浸取12h。2500rpm离心20min，取其上清为原液，分装-20℃保存。用无血清培养基倍比稀释成工作浓度（确保使用终浓度中的DMSO不超过1/1000）。

1.2.3 CCK8法检测细胞活力 收集处于对数生长期的THP-1细胞，以每孔2×l04个细胞接种于96孔板。各组设3复孔，按如下实验设计处理后，于细胞培养箱中孵育后，每孔加入10μl CCK8试剂，37℃避光反应2～3h后，450nm波长（参比630nm）检测每孔的吸光度值，根据公式计算细胞活力。

细胞活力=[（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）]×100%。

1.2.4 不同溶剂对细胞活力影响实验 设空白组：只含培养基无细胞和药物、DMSO对照组（Negative）：1/1000（终浓度，下同）的DMSO、DMSO实验组（NXT）：1/1000的NXTDMSO浸取液、EtOH对照组（Negative）：1/1000EtOH和EtOH实验组(NXT)：1/1000的NXT-EtOH浸取液，细胞培养箱中孵育3h后检测。不同稀释度的NXT对细胞活力影响实验设DMSO对照组（0）：DMSO 1/1000，实验组：NXT浸取液作用细胞的稀释度分别为1/100，1/1000和1/10000，细胞培养箱中孵育3h后检测。

NXT不同作用时间对细胞活力影响实验 设DMSO对照组（0）：DMSO 1/1000，实验组：NXT浸取液作用细胞的稀释度为1/1000，分别作用1h、4h、8h和12h后检测。

1.3 统计学方法

计量资料以平均值±标准差表示，两组组间差异用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 NXT的不同溶剂浸取液的作用效果

CCK8法检测终浓度为1/1000的NXT浸取液对细胞活力的影响，结果显示(Fig 1）：与溶剂对照（Negative）组比较，NXTDMSO浸取液可显著提高细胞活性至115.84%±3.22%（P=0.023）,而NXT-EtOH 浸取液对细胞活力的提高没有显著效果。

2.2 NXT提高THP-1细胞活力的剂量效应

将不同的终浓度的NXT-DMSO浸取液作用于细胞3小时后，可观察到(Fig 2）：和溶剂组（0组）相比较，1/10000稀释的NXT对细胞活力的提高作用有限，终浓度1/1000的药物提高细胞活力的效果最佳（P＜0.05）；继续增加药物浓度，可观察到细胞活性迅速降低，1/100稀释的药物组的细胞活力仅为48.19%±7.29%（P＜0.001）。

2.3 NXT提高THP-1细胞活力的时间效应

将终浓度为1/1000的NXT-DMSO浸取液作用细胞不同时间后，CCK8法检测细胞活力结果(Fig 3）：和溶剂组（0）相比较，NXT作用1h即可有效提高THP-1细胞活力（P＜0.01），作用4h效果最佳（P＜0.001），药效可持续到接近8h（P=0.058）。

Fig 1 NXT的不同溶剂浸取液对THP-1细胞活力的提高作用比较（P为NXT组与对照（Negative）组比较的t检验结果，n=3）。

Fig 2 不同稀释度的NXT对THP-1细胞活力的提高作用比较（NXT组与对照（0）组比较，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001，n=3）。

Fig 3 NXT做用不同时间对THP-1细胞活力的提高作用比较（NXT组与对照（0）组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3）

3.讨论

AS是一种由多因素共同作用引起的全身性疾病，动脉脂质沉积、平滑肌细胞和基质纤维化等因素促进动脉粥样斑块的形成。单核细胞受到CCR2/ MCP-1等多种趋化因子募集迁移，黏附到活化的血管内皮细胞，浸润到内膜下层，可转变成巨噬细胞。同时垂体前叶及外周单核巨噬细胞分泌的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在AS发生中也起到重要作用[4]。MIF可抑制巨噬细胞的游走，同时促进其局部浸润、活化及分泌炎症因子促进AS发生。巨噬细胞吞噬胆固醇等脂质后，转变成泡沫细胞，进一步促进AS斑块的形成[5]。

脑心通是“脑心同治”理论的代表性现代中药方剂，由黄芪66g，赤芍27g，丹参27g，当归27g，川芎27g，桃仁27g，红花13g，醋乳香13g，醋没药13g，鸡血藤20g，牛膝27g，桂枝20g，桑枝27g，地龙27g，全蝎13g，水蛭27g共16味中药组成[6]。临床上，脑心通具有益气活血、化瘀通络的作用，主要用于治疗冠心病、心绞痛、脑卒中等心脑血管疾病。近年随着国家对大力推进中医药继承与创新，脑心通的二次开发取得明显进展：其在治疗糖尿病慢性并发症、原发性高血压、高血脂、动脉粥样硬化以及腰椎间盘突出等症等方面都有较好的效果[7]。

本结果显示，脑心通可提高单核细胞系THP-1细胞的活力，对细胞有一定的保护作用，与刘倩等人的研究结果一致[8]。脑心通中的黄芪多糖能抑制THP-1细胞分泌TNF-α，减缓巨噬-泡沫细胞的形成[9]；川芎有扩张血管、抑制炎症反应的作用[10]；丹参有降脂、抗炎等多种作用[11]。这提示我们脑心通可能通过抑制炎症因子分泌，减轻炎症反应，进而对单核细胞的活力有一定的保护作用，这也与脑心通通过抗炎来减缓动脉粥样硬化的机制相一致。今后，我们将就脑心通的抗炎效应在AS发生中的作用展开深入研究。

我们进一步发现，脑心通在1h就能基本达到最佳药效，有效作用时间接近8h，显示出较其有效成分吸收迅速，有效时间窗较宽。结果表明，1/100稀释的脑心通浸取液对细胞活性表现出较强的抑制效果，这提示高浓度的脑心通对细胞有一定的毒副作用，与李伟霞等论文[7]显示脑心通可引起一定的恶心、呕吐等不良反应相一致。

综上所述，结果显示出脑心通对单核细胞系的保护作用及其作用规律，为进一步研究提供了基础。也提示，尽管传统方药脑心通已经在临床尚广泛应用，其药理机制、作用机理及新的用途尚需更深入的研究。