p38 MAPK阻滞剂对百草枯中毒急性肺损伤中TNF-α的影响

周志兵 张剑锋（通讯作者） 向沥 李霁 罗毅丰

（广西壮族自治区广西医科大学第二附属医院急诊科 广西 南宁 530007）

百草枯（paraquat poisoning，PQ）是民间常用的廉价除草剂，除草效果好而被广泛应用，因此也成为了急诊病人常见的中毒原因之一[1]。既往研究发现，PQ中毒的病人早期即可发现肺组织的弥漫性炎症反应，以急性肺损伤病理变现为主，出现上皮细胞损伤，肺泡内的水肿和出血，大量的炎性细胞浸润，晚期导致以肺损伤为主的多器官功能障碍综合征[2]。百草枯中毒救治成功率低，致死率高达60%～90%。目前关于百草枯中毒的机制尚不明确，研究表明炎症反应失衡以及氧化应激是百草枯中毒的重要机制，本课题组前期研究发现肿瘤坏死因子TNF-α作为重要的炎症介质在百草枯中毒大鼠中是增高的[3]。p38属于MAPK家族中的一员，它作为上游的环境压力应激反应蛋白而能影响TNF-α的表达，关于p38 MAPK阻滞剂在百草枯中毒急性肺损伤大鼠中对TNF-α的影响的报导罕见，本研究将以百草枯灌胃来制作百草枯中毒急性肺损伤大鼠模型，应用p38 MAPK阻滞剂SB203580干预后，观察肺组织中TNF-α的变化。

1.资料与方法

1.1 实验动物

健康成年SPF级雄性SD大鼠36只，体重200～250g，由广西医科大学动物中心提供，动物使用许可证：SYXK桂2014-0003。饲养温度（20±2）℃，自由进水，普通饲料喂养。

1.2 主要试剂、药品和仪器

二氯百草枯结晶体（Sigma公司，美国），p38 MAPK阻滞剂SB203580，RNA保存液，RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒购于TaKaRa公司，ELISA 试剂盒购于华美公司，目的基因引物序列设计合成由南宁科迪公司完成。目的基因碱基序列：β-actin上游引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TNF-α上游引物5'-GGCGTGTTCATCCGTTCTC-3'，下游引物为5'-CTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT-3'；p38MAPK 上 游引 物5'-GTGTCGGTGATGTCAGATGG-3'，下游引物：5'-CAGTATGCAGTCCAGCTCCA-3'。病理图像分析系统（Leica公司，德国）。

1.3 方法

1.3.1 模型制作与分组 将36只大鼠按照随机数字法分成3组，其中生理盐水对照组（NS组）12只，百草枯模型组（PQ组）12只，p38 MAPK阻滞剂干预组（PQ＋SB组）12只。PQ组和PQ＋SB组均给予100mg/kg的百草枯一次性灌胃；NS组给予大鼠与百草枯等量的生理盐水灌胃。p38 MAPK阻滞剂组在灌胃后立即给予10mg/kg/天SB203580腹腔注射，并每24h重复给予SB203580一次，分别于灌胃后1d、3d后处死并留取标本，本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

表1 第 1、3天各组大鼠肺组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相对表达比较（±s）

表1 第 1、3天各组大鼠肺组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相对表达比较（±s）

注：与NS组第1天相比，①P＜0.05，⑤P＜0.05；与NS组第3天相比，②P＜0.05，⑥P＜0.05；与PQ组第1天相比，③P＜0.05，⑦P＜0.05；与PQ组第3天相比，④P＜0.05，⑧P＜0.05；在PQ组内第1天与第3天相比，⑨P＜0.05；在PQ+SB组内第1天与第3天相比，⑩P＞0.05；在PQ组内第1天与第3天相比，⑪P＜0.05；在PQ+SB组内第1天与第3天相比，⑫P＜0.05。

TNF-α p38 MAPK PQ组 PQ+SB组 PQ组 PQ+SB组NS组 第1天 1.954812±0.335586① - 2.199330±0.195087⑤ -第3天 4.111881±0.997487② - 3.475220±0.431125⑥ -PQ组 第1天 - 0.190781±0.030778③ - 0.534773±0.014130⑦第3天 2.109590±0.422647⑨ 0.062689±0.034125④ 1.577948±0.083984⑪ 0.169343±0.016417⑧PQ+SB组 第1天 - - - -第3天 - 0.878399±0.454120⑩ - 0.500709±0.065733⑫

1.3.2 标本采集 10%水合氯醛以0.03ml/kg进行腹腔注射麻醉，打开腹腔，腹主动脉放血处死，剖开颈部皮肤暴露气管，同时开胸暴露心肺及大血管，结扎左侧肺门以后使用10ml注射器吸取PBS缓冲液扎入右心室从而灌注冲洗肺中血液。取以下样本：①结扎左主支气管，行支气管肺泡灌洗（BALF），收集灌洗液于2000rpm离心15min，留取上清，并分装入 1.5ml EP管内置于-80℃冰箱中保存备用。②取右下肺用RNA保存液畳于-20℃摄氏度冰箱保存备用，待做Real-time PCR检测，余下肺保存备用；3、左肺10%甲醛固定48h，后续病理检测。

1.3.3 标本病理染色检测 取48h固定后的左肺，脱水、浸蜡、包埋、切片，行苏木精-伊红染色，应用病理图像分析系统，使用光学显微镜对肺组织的病理变化进行观察。

1.3.4 取肺泡灌洗液 按TNF-a的Elisa试剂盒说明书操作，测得OD值，通过标准曲线算出浓度。

1.3.5 各组大鼠肺组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的检测采用qRT-PCR 法 使用RNA提取试剂盒对肺组织总RNA进行提取，用逆转录试剂盒逆转录 RNA 成cDNA。内参选用β-actin，选择20μL体系进行qRT-PCR扩增。用2-△△CT表示受检组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相对表达量。

1.4 统计学方法

2.结果

实验开始后，NS组大鼠进食正常，毛发顺白，精神状态尚好，行动自如。PQ组大鼠进食、饮水量较NS组减少，毛发粗糙、稀疏，精神疲、行动缓慢，易激惹，口唇及鼻部偶见血性分泌物。PQ＋SB组大鼠可见与PQ组类似的中毒症状，但症状较PQ组轻。

2.1 肺组织病理学改变 NS组的大鼠肺大体观呈均匀粉红色，包膜光滑、柔软、弹性好；光镜下观察组织结构清晰，肺泡腔无炎性细胞浸润，肺泡壁薄，间质血管无扩张，支气管黏膜上皮完整。PQ组的大鼠未灌洗之前肺大体观可见组织肿胀，色不均匀，表面可见大面积出血点；光镜下组织内可见较多肺泡萎陷，肺泡壁毛细血管扩张、淤血，伴灶性肺泡内出血，部分肺泡腔内有水肿液，肺内可见大量炎症细胞浸润，肺间质水肿，肺泡间隔不同程度增宽。PQ＋SB组的大鼠肺组织病变轻于染毒组，肺泡内出血及炎症细胞浸润减少，肺间质水肿程度减轻。见图。

图 大鼠肺组织病理学变化

2.2 各组大鼠肺组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表达比较

PQ组大鼠在第1、3天肺组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表达量均高于相同时间点NS组（P均＜0.05）；PQ＋SB组第1、3天大鼠肺组织中则表达量明显低于相同时间点PQ组（P均＜0.05）。PQ组内不同时间点的大鼠肺组织中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表达量差异有统计学意义（P＜0.05）；PQ+SB组组内不同时间点的大鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 各组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平比较

PQ组在第1、3天大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平与NS组相比有明显差异（P＜0.05）；PQ＋SB组第1天大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平与PQ组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而在第3天则明显低于PQ组（P＜0.05）。PQ组和PQ＋SB组同一组内的不同时间点的大鼠肺泡灌洗液TNF-α蛋白水平差异无统计学意义（P均＞0.05），见表2

表2 第 1、3天各组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α蛋白的表达比较(ng/ml,±s)

表2 第 1、3天各组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α蛋白的表达比较(ng/ml,±s)

注：与NS组第1天相比，①P＜0.05；与NS组第3天相比，②P＜0.05；与PQ组第1天相比，③P＞0.05；与PQ组第3天相比，④P＜0.05。

组别 TNF-α第1天 第3天PQ组 0.221268±0.042217① 0.265178±0.011183②SB组 0.194063±0.015772③ 0.152062±0.022503④NS组 0.021573±0.011077 0.029496±0.005304

3.讨论

百草枯病人存活率低，尚未有良好的治疗方法。病人食入后由于无法及时洗胃常常已经吸收，而百草枯早期可与胺类物质竞争肺泡Ⅱ型细胞的能量依赖性多胺摄取途径而选择性地在肺内聚集[4]。这种摄取系统主要存在于肺泡Ⅱ型细胞，同时也存在于气管Clara细胞和肺泡Ⅰ型细胞[5]。因此早期发现病人时百草枯往往已经在肺中积累较高浓度，而目前研究发现的百草枯中毒机制包括了氧自由基损伤、氧化应激损伤、胞内钙稳态失衡、炎症反应失衡、线粒体损伤、DNA 损伤与细胞凋亡等[6]。众多研究发现炎症反应在百草枯中毒的病理发展进程中起重要作用，Yang S等[7]提出PQ中毒早期有大量炎性细胞和免疫细胞浸润，其能分泌多种炎性介质，而炎性介质再反过来促进炎性细胞的浸润。

p38 MAPK属于MAPK家族中的一员，是一条极其重要的环境压力应激反应通路。p38 MAPK最初被认为是LPS刺激的巨噬细胞中检测到的一种酪氨酸磷酸化蛋白，对炎症细胞因子的产生具有重要作用，是亚砷酸盐、热休克或白介素-1刺激的细胞中MAPK活化蛋白激酶2（MK2）的上游激活激酶[8]。广泛的研究表明，p38 MAPK在许多不同的组织中发挥着关键作用[9]。而Wang,X[10]等发现在百草枯中毒急性肾损伤中p38 MAPK的磷酸化是增加的。TNF-α则主要由淋巴细胞、激活的巨噬细胞、内皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞等分泌。参于了机体的炎症反应和免疫过程，是介导机体炎症反应的关键因子[11]。

本实验采用百草枯灌胃法，以100mg/kg的剂量来构建大鼠急性肺损伤模型，病理形态学上可见PQ组明显较同一时间点的NS组炎症明显，肺组织损伤加重，这与课题组前期构建的百草枯中毒急性肺损伤模型病理表现相同[12]。而应用了p38 MAPK阻滞剂后，则改善了PQ所致的肺组织的损伤。SB203580是一种被应用广泛的高效p38 MAPK阻滞剂，Chen X[13-14]等人用该阻滞剂制作了相关模型，发现成功降低了p38的磷酸化。通过本次实验结果，我们发现肺组织中的TNF-α和p38 MAPK mRNA表达在PQ组的表达均高于同一时间点的NS组，而应用阻滞剂后在同样时间点则明显降低了TNF-α和p38 MAPK mRNA的表达。但是同一组内,只有PQ组TNF-αmRNA随时间增加而增高，PQ+SB组无明显差异。这可能是由于p38阻滞剂作用于百草枯中毒的大鼠后，对TNF-αmRNA干预的降低速率在三天内较慢。检测肺泡灌洗液中的TNF-α蛋白表达水平发现，PQ组不同时间点表达均高于NS组，而应用阻滞剂后在第1天无明显差异，在第三天则能降低TNF-α蛋白表达水平。PQ+SB组也未能表现出TNF-α蛋白水平的时间依赖性减低。说明在p38 MAPK阻滞剂干预后，百草枯中毒肺组织中的炎症介质TNF-α蛋白表达水平在第一天的影响不明显，而在第三天可以见到明显的降低。由p38 MAPK的直接作用底物可知[15]，TNF-α本身不是p38 MAPK的直接作用底物，而是经过中间相关分子后影响TNF-α的表达。YU[16]等做的模型中认为p38 MAPK能影响核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的磷酸化，而NF-κB能影响TNF-α的转录。因此可解释其在一天内的影响并不明显。

综上，百草枯致急性肺损伤时，p38 MAPK阻滞剂可以抑制肺组织中TNF-α蛋白和mRNA的表达，改善肺组织的炎症反应，从而减轻肺损伤，这提示了在百草枯中毒急性肺损伤过程中，p38 MAPK可以通过影响TNF-α的表达，从而影响肺损伤时的肺组织炎症反应。