ARMD与转铁蛋白受体基因单核苷酸多态性相关性研究

陈海霞，张 璐

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是发达国家老年人致盲的首要疾病[1]。ARMD主要损害视网膜的黄斑区，疾病早期的病理学特点是蛋白质、脂质和炎症介质等细胞外沉积物在视网膜形成玻璃膜疣[2]。ARMD分为两型：干性ARMD和湿性ARMD。干性ARMD的特点是视网膜色素上皮(RPE)细胞的衰老和地图样缺失，而湿性ARMD的特点是RPE和脉络膜血管的异常生长。ARMD患者视网膜分析显示，脂质沉积在Bruch膜和RPE细胞导致细胞凋亡[3]。

ARMD是一种多因素疾病，其发病受非遗传因素和遗传因素影响。非遗传因素中主要与年龄、环境、饮食等相关[4-5]。许多研究证明，在老化的视网膜中氧化应激和活性氧在疾病的病理学中发挥了重要作用[6]。视网膜对氧化应激高度敏感，因为视网膜具有氧消耗量大、代谢活性高并且直接暴露于光等特点。过量的活性氧可以损害视网膜脂质、蛋白质和核酸，随后导致视网膜细胞死亡。研究发现，在ARMD患者视网膜中氧化损伤增加，玻璃膜疣中的氧化蛋白含量也增加[7]。大量证据表明，氧自由基的损害与包含ARMD在内的年龄相关的神经退行性疾病相关[8-9]。然而，当体内各种原因导致氧自由基的清除失衡，从而出现毒性蛋白(包括脂褐素)的积累，导致细胞外玻璃膜疣出现。所有这些机制均会导致RPE功能障碍或RPE细胞的死亡，从而导致ARMD的发生[10]。

在细胞膜中许多酶的激活需要铁的辅助[11]。血液循环中的铁和转铁蛋白结合形成配体与细胞膜表面的转铁蛋白受体(transferrin receptor，TFR)结合，通过血-视网膜屏障进入细胞内发挥作用。因此，当TFR功能异常时会影响体内铁的平衡，导致氧自由基产生增多，当氧自由基含量超过视网膜自身清除能力时，会导致视网膜的凋亡，最终导致患者视力下降。TFR有很多种类，其中作用最重要的受体之一就是TFR2。TFR2基因定位于7q22.1，其编码的蛋白质是单通道Ⅱ型膜蛋白，介导细胞摄取铁、结合铁。TFR2基因单核苷酸多态性包括rs2075674、rs41295942、rs527374887等。而TFR2基因多态性与ARMD是否相关，这个问题一直是近年来国内外研究的热点。相关的研究也已经在白种人和日本人中有过类似的探讨。白种人中TFR2基因rs2075674是ARMD的危险因素，其与干性ARMD相关性更大[12]。而在日本人中研究得到的结果是TFR2基因多态性与ARMD无相关性。国内没有相关的研究，所以我们选择了ARMD患者与正常人分别作为病例组与对照组，应用限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应法(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR)对TFR2基因的多态性与ARMD的相关性进行了分析。

1对象和方法

1.1对象病例组：选取2014-06/2016-06哈尔滨医科大学附属第一医院确诊为ARMD(无影响视力的其他眼部疾病)的患者200例，均无血缘关系，其中干性ARMD患者100例，湿性ARMD患者100例，平均年龄65±15岁，男120例，女80例。ARMD的诊断和分型原则：45岁以上患者双眼渐进性视力减退，眼底散在玻璃膜疣，或后极部视网膜脉络膜萎缩病灶，排除其它眼病者，即可诊断为干性ARMD；突然严重视力障碍，后极部深、浅层出血伴有新生血管和玻璃膜疣或黄斑区盘状瘢痕，并排除其它眼病者，即可诊断为湿性ARMD。对照组：选取2014-06/2016-06哈尔滨医科大学附属第一医院体检中心健康志愿者100名，直接检眼镜未检出眼底病变，平均年龄55±5岁，男55名，女45名。所有选择的患者和健康志愿者均了解试验目的和意义，并签署知情同意书，已获得哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准。

图1TFR2基因PCR产物电泳图。

1.2方法提取人类基因组DNA，根据相关文献设计TFR2基因多态性位点rs2075674 PCR引物：TFR2-forward：5’-ACTCCCTGCCGTCGAGTTCT-3’；TFR2-reverse：5’-ACTCCCAGAGACCAAGAGCG-3’。PCR仪扩增，94℃预变性5min，95℃变性30s，56℃变性30s，72℃变性1min，共29次循环，72℃延伸1min。制备20g/L琼脂糖凝胶，60V恒压电泳1.5h，取出凝胶。限制性核酸内切酶酶切，取PCR产物2μL，加入MsPA1Ⅰ内切酶0.3μL，CutSmart缓冲液1μL，并加入超纯水使溶液体积达到10μL。置于36℃水浴锅恒温水浴4h，待下一步试验使用。取8μL酶切后产物加入到胶孔中，最后一孔中加入250bp-Ⅱ DNA梯形标记物5μL。60V恒压电泳1.5h，取出凝胶。将琼脂糖凝胶置于CDD凝胶成像分析系统配套软件中进行观察处理。比较各组间的基因型频率，并按照Hardy-Weinberg平衡原理确定样本的群体代表性。

统计学分析：应用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用χ2检验比较各组间的基因型频率，并按照Hardy-Weiberg平衡原理确定样本的群体代表性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 TFR2聚合酶链反应产物电泳结果PCR产物扩增后TFR2可见381bp的电泳条带(图1)。

2.2 TFR2基因限制性核酸内切酶酶切后产物电泳结果PCR产物经过限制性核酸内切酶酶切后TFR2可表现为CC、CT两种基因型。CT基因型可被切开，表现为两条条带，一条381bp，一条198bp；CC基因型不可被限制性核酸内切酶切开，表现为一条381bp的条带(图2～3)。

2.3基因型频率结果经χ2检验，TFR2(rs2075674)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。rs2075674基因型频率分布：ARMD组与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=6.494，P=0.011，表1)；湿性ARMD组与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=11.054，P=0.001)；干性ARMD组与对照组比较，差异无统计学意义(χ2=1.418，P=0.234，表2)。

图2湿性ARMD TFR2基因单核苷酸多态性(rs2075674)代表图。

图3干性ARMD TFR2基因单核苷酸多态性(rs2075674)代表图。

表1 ARMD组与对照组TFR2基因型频率例(%)

注：对照组：健康志愿者。

表2 ARMD亚组与对照组TFR2基因型频率例(%)

注：对照组：健康志愿者。

3讨论

本研究中我们首次发现，TFR2基因多态性rs2075674与中国东北地区人群ARMD的发病具有相关性(P=0.011)。rs2075647与中国东北地区人群中湿性ARMD的发生有很强的相关性(P=0.001)。此外，本次研究还发现TFR2基因多态性rs2075674与中国东北地区干性ARMD的发生无相关性(P=0.234)。本次试验结果得出，rs2075674与中国东北地区人群中干性ARMD无相关性。但是这一结果并不能证明该单核苷酸多态性与ARMD无关，却从侧面反映出该基因对中国东北地区干性ARMD的发病没有起到至关重要的作用。

关于TFR2基因多态性是否与ARMD的发病相关，一直以来是国内外研究的热点。Imamura等[11]研究发现，在日本人中TFR2基因多态性与ARMD的发生无相关性。而我们的试验首次应用RFLP-PCR法发现了TFR2基因单核苷酸多态性rs2075674与ARMD发病有相关性，其中CT基因型与ARMD发病相关性较高。Imamura等研究着重于视网膜在光暴露后感光细胞中亚铁离子的代谢过程，而且该研究的基因扩增于ARMD小鼠模型，这可能是其未发现TFR2基因单核苷酸多态性与ARMD发病相关的主要原因。本研究发现，CT基因型会增加ARMD患者的发病风险，后续试验可以通过检测CT基因型患者的感光细胞外液中亚铁离子、活性氧、羟自由基等浓度来丰富本项课题。

基于ARMD有干性和湿性两种分型，且这两种分型的临床表现和治疗方法不尽相同，本试验在ARMD组与对照组进行比较分析的基础上，将干性、湿性ARMD与对照组分别进行了对照分析。本研究发现rs2075674与湿性ARMD相关性更大，而与干性ARMD无相关性。湿性ARMD的病理学特点为视网膜血管的异常生长，干性ARMD的病理学特点为脂质的沉积导致视网膜RPE的缺失。根据ARMD的病理学特点，我们有理由相信rs2075674参与了湿性ARMD形成过程中视网膜新生血管的形成。但是Daniel等通过对白种人研究发现，rs2075674与干性ARMD具有较高的相关性，而与湿性ARMD的相关性则较低。Daniel等研究结果与本次研究结果具有差异性，可能说明白种人与黄种人具有遗传差异性。未来我们可以扩大样本量，将不同种族人群的ARMD患者进行基因层面的对比分析，这可能会为ARMD发病机制的研究开辟新的道路。

本研究中，ARMD试验组和对照组中均未发现TT基因型，这可能说明中国东北地区人群的TFR2基因不存在TT基因型。而Daniel等基于白种人ARMD患者的rs2074674研究均存在TT基因型。造成以上试验结论差异性的原因可能是由于白种人与黄种人具有不同的遗传特性，也有可能是本次试验的样本量较少，所得结论并不能代表中国东北地区所有人群，以后我们可以通过扩大样本量进一步验证。

随着全世界学者对ARMD发病机制的关注度越来越高，许多学者认为ARMD的发病机制可能是多种机制共同作用的结果，不可否认的是遗传易感性是ARMD不可忽视的一种发病途径。因此不同人种对于ARMD的发展进程也存在较大的差异。目前ARMD的发展与不健康的饮食结构、吸烟等不良环境关系密切。中国汉族人与日本人和白种人的种族、饮食、生活习俗、文化背景等方面均有不同，导致ARMD遗传易感性在不同人群中有较大的差距。这可能是本次课题研究结果与欧洲、日本有差别的原因之一。

我们的研究发现也许会在今后人们对ARMD发病机制的探索提供新的思路。后续试验也可建立ARMD的动物模型，检测动物模型眼中TFR2基因的表达水平，用以研究TFR2基因表达水平在ARMD时是否有变化，若有条件也可收集相关患者眼内部分玻璃体检测其TFR2表达水平，进一步行相关试验。另外，本试验病例组与对照组样本数量均停留在100数量级上，如果将样本量扩大至1000级，可能会出现更有意义的结果。